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PAGE 15 目录 TOC \o 1-3 \h \z \u 生产部克隆组操作流程 1 一、PCR扩增目的片段 1 二、PCR产物的纯化（或者切胶纯化） 4 三、DNA片段的酶切及纯化 6 四、质粒的提取及酶切 7 五、连接反应 9 六、感受态细胞的制备 10 六、转化 12 七、挑取单克隆 13 八、菌液PCR验证 14 九、测序 16 十、转交 16 附：克隆组常用试剂配方 17 生产部克隆组操作流程 一、PCR扩增目的片段 实验原理:PCR(polymerase chain reaction)是一种常用的分子生物学技术，常用于体外扩增特异的DNA片段。基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链（有时直接用单链DNA作为模板），以便它与引物结合；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三个基本过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。 1、实验仪器及试剂 1.1实验仪器：PCR仪： LongGene L96+ Thermal cycler 离心机：TGL-16, 湘仪 凝胶电泳仪：Tanon EPS 300 凝胶成像系统：Tanon 2500， 其林贝尔离心机：LX-5000 微波炉 1.2实验试剂：天根pfu DNA polymerase(2.5U/ul) 天根dNTP（10mM/ul) TAKARA DNA marker（DL5000、DL10000） 1XTBE缓冲液 超纯水 2、实验步骤： (1)将干粉引物以12000rpm离心30s，小心打开管盖按照引物订单报告加灭菌的超纯水稀释至10mM，震荡混匀（打开盖子前一定要离心，避免干粉引物飞溅）。 （2）在0.2ml的离心管中加入以下成分： 质粒模版（25ng/ul） 1ul Primer1（10mM） 1ul Primer2（10mM） 1ul 10×Pfu Buffer 5ul dNTP mixture（10mM） 1ul Pfu DNA 酶(2.5u/ul) 0.5ul ddH2O ?ul 总体积 50ul （模板一般可以是质粒、单或双链DNA片段、cDNA等或其他不同复杂类型的模版，加入的量有一定的变化。一个典型的50ulPCR反应，加入的模板量为0.1ug-2ug；dNTP的浓度为50umol/L-200umol/L；每条引物的量为0.1umol-1umol，加入的酶为1.5U-2.5U。最后加水保证总体积为50ul，做多管的时候可以把除引物模板以外的组分混合后分装，离心5s混匀，然后置于PCR仪的工作台上）。 （3）设置PCR运行参数并运行： （4）用微波炉加热0.75%琼脂糖凝胶至完全溶解，在胶板上插上梳子倒一块胶，静置凝固。 （5）PCR反应结束后取2ul产物进行电泳，检验是否扩增成功，确定有目的条带后其余样品进行PCR产物纯化（或胶回收）。 二、PCR产物的纯化（或者切胶纯化） 实验原理：PCR产物一般都含有过量的引物、DNA聚合酶、引物二聚体、模板DNA及dNTP等，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切反应、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。本实验采用Biospin胶回收试剂盒对PCR产物直接进行纯化，Extraction Buffer促进60bp-23kb间的DNA片段选择性的吸附在膜上，经Wash Buffer洗涤除去引物二聚体、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料等，最后经去离子水将目的DNA片段从膜上洗脱下来。 1、实验仪器及试剂 1.1实验仪器：湖南湘仪离心机：TGL-16, 金属恒温加热器：博彩生物 HB301 1.2实验试剂：Biospin胶回收试剂盒 超纯水 2、直接纯化实验步骤： （1）向PCR产物中加入5倍体积的Extrac