第二十五章 克隆动物培育技术.ppt

3、核移植 在显微操作仪下将供体细胞核移入受体细胞中。根据供体移入到受体细胞的不同部位，可以分为带下（透明带下）注射和细胞质内注射。 4、核质融合及卵母细胞质的激活 核质融合的方法有： (1)病毒融合法 如将仙台病毒与供体核一起注入去核的受精卵中，促进细胞融合。 (2)电融合法 将重构胚置于电场下，以电脉冲促进融合。 (3)Honolulu技术 利用吸液管将遗传物质取出，然后注入卵细胞中。以机械和化学激活方式促使重构胚的融合。 5、重构胚的培养和移植 一种是体外培养，在适当的培养条件下培养到一定时期，然后进行胚胎移植。 另一种方法是采用中间受体培养，在核质融合后，将重构胚用琼脂糖包埋，移入动物的输卵管或子宫，发育到桑椹胚或囊胚后，再重新移入假孕受体子宫。 6、重复克隆(连续核移植) 如有必要，将核移植胚胎培养至桑椹胚或囊胚后继续做核供体重复克隆，可以显著提高克隆成活率。 7、克隆动物的鉴定 克隆动物出生后，从形态、性别上和分子生物学水平上鉴定，以确定所克隆的动物在遗传上是否真的来源于供体细胞系。 分子生物学鉴定方法有PCR、Southern、Northern等。 * 第二十五章 动物克隆技术 克隆动物(clonal animal)是指人们采用动物克隆技术得到无性繁殖的在遗传上与亲本动物完全相同的动物。 1997年世界卫生组织解释克隆为遗传上同一的机体或细胞系(株)的无性生殖。 分子水平上的克隆是指DNA分子的复制。 细胞水平上的克隆是指细胞或组织培养。 个体水平上的克隆是指动、植物的无性繁殖，其中，动物克隆偏重于指细胞核移植。 第一节 动物克隆技术的理论基础及发展简况 动物克隆技术的理论基础是动物细胞发育的全能性。 ①动物细胞核都含有与生殖细胞相同的遗传信息，因此具有发育的全能性。 两方面突破： ②卵母细胞的细胞质中含有启动供体核重新编程(reprogramming)的各种因子。已经分化的细胞核重新回到未分化的起点，重新编程形成重构胚并被激活。 一、细胞发育的全能性 （一）全能性的概念 全能性(totipotency) 是指分裂球发育成为完整胚胎的能力。包括细胞发育全能性和细胞核发育全能性。 1、细胞的全能性 细胞分化能力的强弱称为发育潜能。 根据发育潜能可以将细胞分成全能性、多能性、单能性细胞及终末分化细胞。 受精卵以及胚胎干细胞的发育具有全能性；多能造血干细胞具有的发育潜能称为多能性 ；终末分化细胞，如人的成熟红细胞 。 细胞全能性的基础在于所有细胞的细胞核包含一个物种的全套染色体组，具有发育成一个完整个体所需要的全部遗传物质。 2、细胞核的全能性 细胞核的全能性是指一个细胞核具有该物种完整的遗传信息，在适当条件下能够发育成一个完整个体的能力。 将分化的细胞的细胞核导入去核的卵细胞或受精卵，发育成一个完整的个体（如体细胞克隆动物），就是细胞核全能性。 （二）证明细胞全能性的研究事例 1、动物早期胚胎细胞的全能性 德国Virchow R. 论断“细胞来自细胞”。 Roux(1888) 用烧烫的针破坏蛙2细胞胚胎。 Driesch(1892)以海胆做实验。 Spemann（1901～1903）用细发结扎蝾螈受精卵。 Roux(1888)用烧烫的针破坏蛙2细胞胚胎观察胚胎发育情况 2、已分化的动物细胞的全能性 Spemann 蝾螈受精卵结扎实验 ⑴ 两栖类的核移植实验 Spemann的蝾螈受精卵结扎实验(1938) 用头发将受精卵沿第一次卵裂面结扎成2个半球，使细胞核留在其中的一个半球中，两半球之间留有一条小缝隙，当有核的一侧发育到8细胞期时，另一侧还未开始分裂；当有核的一侧发育到16细胞期时，一个细胞核进入无核的一侧，此时将胚胎完全结扎；140 d后，每一侧都发育成为一个完整的胚胎。 1952年，美国科学家Briggs和King以美洲豹蛙做核移植实验。将未分化的蛙囊胚细胞的细胞核移植到蛙去核受精卵中，获得了正常发育的蝌蚪。 后来的实验得出结论：蛙胚胎细胞核的发育潜能随着胚胎发育的进程、细胞分化的提高而逐步下降。 1962年， Gurdon通过连续核移植，将爪蟾蝌蚪已经分化的肠上皮细胞核移植到去核的卵母细胞中，获得了可育的成熟个体。 1977年，Gurdon以一只白化爪蟾蝌蚪细胞为供体，克隆到了30只白化非洲爪蟾。 ⑵ 哺乳类的核移植实验 1981年，瑞士科学家Illmensee和美国科学家Hoppe首次报道哺乳动物细胞核移植获得成功。 ICR(白色) ICR(白色) (棕色) (黑色) ⑵ 哺乳类的核移植实验 1983年，McGrath和Solt结合显微技术与细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎与未受精卵用病毒诱导融合的方法获得了后代 。 1996年，Campbell等采