核酸提取及常见问题精选.ppt

DNA提取的几种方法 天为时代 基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它  基因组DNA一CTAB法 天为时代 口cTAB法原理(植物DNA提取经典方法) cTAB( hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基 溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合 物 该复合物在高盐溶液中(0.7 mol/L Nacl)是可溶的,通过有机溶剂 抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来 注:CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。  基因组DNA一CTAB法 天为时代 口CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCIEDTA、 NaCICTAB|巯基乙醇 (pH80) (pH80) 0.1%(V/V) 终浓度10mM20mM14M|20使用前加入 Tris-Hc(pH80)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏 EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制 DNase活性; NaC提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中 CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离 β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除  基因组DNA-cTAB法45 口CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-Hcl↓EDA、 NaCI CTAB PVP40B巯基乙醇 终浓度100mM20mM14M 5% 2%(VV) 使用前加入 ☆PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶 的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能 和多糖结合,有效去除多糖  基因组DNA_SDS法 三天为时代 口SDs法原理 SDS是一种阴离子去垢剂,在高温(55~65℃)条件下能裂解细 胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖 杂质沉淀,离心后除去沉淀; 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA 口SDS法DNA提取缓冲液 Tris-HCI EDTA 组份(pH80)(pH80) NaCI SDS 终浓度10mM20mM0.M2%  基因组DNA一其它方法 三天为时代 口根据细胞裂解方式的不同有: 物理方式:玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式:异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式:酶法  基因组DNA一其它方法 天为时代 口根据核酸分离纯化方式的不同有: 吸附材料结合法 硅质材料 高盐低pH值结合核酸,低盐高plH值洗脱。 快捷高效。 阴离子交换树脂低盐高值结合核酸高盐低值洗脱 适用于纯度要求高的实验。 磁珠 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物,从而达到分离目的。  基因组DNA一其它方法 天为时代 浓盐法: 利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同,将二者分离 有机溶剂抽提法: 有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用 密度梯度离心法 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物  质粒DNA一碱裂解法 天为时代 口碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多,且染色体DNA为线状分 子,而质粒DNA为共价闭合环状分子; 当用碱处理DNA溶液时,线状染色体DNMA容易发生变性,共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象; 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀,而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中,从而可通过离心将两者分开。  质粒DNA一碱裂解法 天为时代 口碱裂解法流程图 对数期菌体 上清液 沉淀 溶液I充分重悬 抽提 干燥溶解 溶液∏裂解 酒精沉淀 质粒DNA溶液 溶液I中和 离心洗涤