实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定课堂.pptVIP

1 碱性磷酸酶的提取及其 比活性测定 带教 : 张学礼、戴薇薇 龚张斌、黎志萍 2 材料选择 细胞的破碎 分离纯化 鉴定 3 碱性磷酸酶 (ALP , AKP) Alkaline phosphatase 4 一、实验目的 1 、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶 的原理和方法； 2 、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、 得率及纯化倍数的概念及计算； 3 、了解 AKP 的临床意义及纯化蛋白质的一般 方法。 5 二、实验原理 1 、 AKP 概述 ① 催化有机单磷酸酯水解，并有转移磷酸基的作用 ②最适 pH ： 8.6 ～ 10.3 ③ 特点：特异性低 6 ④体内位置：细胞膜表面 - 肾小管的筛状缘 - 肠粘膜的微绒毛 - 胆小管的细胞膜缘 - 肝窦状腺表面 - 胎盘合体细胞滋养层细胞外表面 7 ⑤正常血清 ： ALP 主要来自肝（或胆管）和骨骼，约各占总活性 的一半。 ⑥临床意义：血清 ALP 活力增高 常见于 - 肝胆疾病（胆道阻塞等） - 骨骼疾病（佝偻病等） - 甲状腺功能亢进 - 妊娠和生长期儿童 8 2 、 AKP 的分离、提取、及纯化 整个制备过程可分为 5 个阶段： ①材料的选择和预处理， ②细胞的破碎， ③提取， ④纯化（包括盐析、有机溶剂提取、层析、电泳 等）， ⑤浓缩、干燥及保存。 9 ① 取材 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的 组织 本次实验：肝脏 10 ② 生物组织与细胞的破碎 ? 机械破碎法 ： 高速组织捣碎机、匀浆器、研钵 ? 渗透破碎法 ： 低渗条件使细胞溶胀而破碎 ? 反复冻融法 ： ? 超声波法： 超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而 使细胞破碎 ? 酶法 ： 如用溶菌酶破坏微生物细胞 11 ③ 选择合适分离提取方法 把混在酶制剂中的大量杂蛋白及其它大分子 物质（核酸、脂类、多糖）去除掉 把酶从溶液中提取出来 12 有机溶剂方法 —— 有机溶剂分段沉淀法 原理： 利用不同的蛋白质在不同浓度的有机溶剂 中有不同的溶解度而进行分离。 13 有机溶剂： ① 正丁醇 能去除与 pro 结合的脂类物质，使 pro 溶解在溶 液中 ② 乙醇 30% AKP 溶解状态 60% AKP 沉淀状态 ③ 丙酮 33% AKP 溶解状态 50% AKP 沉淀状态 通过离心，去除 部分杂蛋白 通过离心，进一 步去除杂蛋白 14 ④ 保护酶活性措施 a. 低温条件下操作 b. 所有试管均需洗干净 c. 选择合适的 pH 及合适的缓冲体系，以稳 定酶活性 Mg(Ac) 2 ~ NaAc 混合液提取 AKP pH 8.8 Tris 缓冲液测 AKP 活性 保护和稳定 AKP 15 2g 新鲜兔肝剪碎 → 匀浆管 加 0.01M Mg(Ac) 2 - 0.01 M NaAc 混合液 2ml ，匀浆 匀浆液入离心管 用 4ml 上述混合液冲洗匀浆器 ，并倒 入离心管，混匀，记体积 V A ? A 液 A 1 管 A 2 管 剩余 A 液 0.1 ml A 液 + 0.1 ml A 液 + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris 4.9 ml 生理盐水 三、操作步骤 （待测酶活性） （待测蛋白质含量） 加 2ml 正丁醇，搅拌 3-5 ，室温放置 30 ， 过滤，入离心管 16 上述滤液 加 等体积 冷丙酮，混匀， 离心 2000 rpm 、 5 分钟 上清入回收瓶 沉淀 加 4.0 ml 0.5 M Mg(Ac) 2 , 搅拌，记体积 V B ? B 液 0.10ml B 液 + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris B 1 管 B 2 管 剩余 B 液 V B 0.1 ml B 液 + 4.9 ml 生理盐水 加 0.45 V B 冷乙醇 96% → 30% ，混匀， 离心 2500 rpm ,5 分钟 （待测酶活性） （待测蛋白质含量） 17 上清 弃沉淀 入离心管 ，记体积 V B ‘ ， 加 0.83 V B ‘ 冷乙醇 96% （ 30% → 60% ） 混匀， 离心 2500 rpm ,5 分钟 上清入回收瓶 沉淀 加 0.01M Mg(Ac) 2 - 0.01 M NaAc 混合液 4ml ，搅拌， 记体积 Vc ? C 液 C 1 管 C 2 管 剩余 C 液 Vc 0.10ml C 液 + 1.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris 0.1 ml C 液 + 0.4 ml 生理盐水 加 0.5 Vc 冷丙酮 → 33% ， 混匀 , 离心 2000 rpm ,5 分钟 （待测酶活性） （待测蛋白质含量） 上述离心结果 18 上清 弃沉