基因工程菌培养参考资料.pptVIP

31 3 、诱导时间对外源蛋白表达的影响 诱导时间 ：加入诱导剂后的培养时间 随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加， 但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒 性，合成速率下降，甚至产物被分解。 诱导时间对酶表达水平和活力的影响 诱导时间 酶活力 酶表达水平 0 0.02 1 52.3 37% 2 118.8 57% 3 120.8 67% 4 165.0 68% 5 139.9 64% *L- 天冬酰氨酶 32 4 、诱导时机对表达的影响 诱导时机指加入诱导剂的时间 以天冬酰氨酶表达为例，见表。在 A 600 =0.295*10 时生长速度比较快，这时菌 体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶 活和表达水平都较高。而菌体进入对数期 后期，由于发酵液中营养的消耗，及代谢 产物的积累，使菌体的生长速度受到抑制。 在此状态下诱导，表达显然受到影响。 33 诱导时机对酶表达水平和活力的影响 生物量（ A 600 ） 酶活力 酶表达水平 0.015 6.0 15.0% 0.049 19.1 31.1% 0.160 72.5 41.5% 0.225 102.6 49.8% 0.295 165.0 57.7% 0.360 105.5 53.4% 0.410 62.4 44.5% 0.450 30.2 22.5% *L- 天冬酰氨酶 0.034 0.111 0.065 0.07 0.065 0.05 0.04 34 5 、乙酸对生长和表达的影响 （ 1 ）乙酸的产生及抑制作用机理 当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化 碳产生所需要量或在缺氧的条件下便会产生 大量的乙酸，特别是在培养时间较长的高密 度发酵过程中，问题更为严重。 为什么会产生乙酸？ Han 认为细菌在低比生长速率下通过氧化代 谢（三羧酸循环）的作用产生的能量足以满 足合成和异化的需求，不会产生乙酸，而在 髙比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不 能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径 提供 ATP 和 NADH 。 35 乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰 酶（ Pta ）和乙酰激酶（ Ack ），它们催化葡 萄糖代谢中从乙酰辅酶 A 生成乙酸的两步酶促 反应。 EL-Mansi 和 Luli 假设的乙酸抑制机理是：乙酸 在中性 pH 环境中以离子化（ CH 3 COO － ）和质 子化（ CH 3 COOH ）两种形式存在，质子化的 乙酸具有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞 内，在细胞内（ pH7.5 ）解离成 CH 3 COO - 和 H ＋ ，这样就降低了膜内的 pH 值，使膜内外的 pH 差减小，减弱了质子的推动力，产生的能 量就被大大减少，扰乱了细胞的正常代谢和生 理活性。 36 （ 2 ）减少乙酸积累的对策 ? 宿主菌 不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱 变使乙酸生成途径中的两个关键酶， 有一个突变了或活性降低了，使乙酸 合成受阻。 37 ? 培养基 培养基组成能影响乙酸的产生，特别是碳源 的含量影响最大。在基本培养基中大肠杆菌 产生的乙酸比在复合培养基中产生少。另外 用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成， Han 等在培养基中加入某些氨基酸（甘氨酸、 甲硫氨酸）减轻了乙酸的抑制作用，提高了 重组菌的生长速率和重组蛋白的产率。 Klemam 等研究了培养基 pH 值对产生乙酸的 影响，发现重组大肠杆菌 W3200 在葡萄糖浓 度为 5g/L 、 pH6.0 的培养基中乙酸生成量为 6g/L. 而 pH7.5 为 12g/L 。 38 ? 降低比生长速率 细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高， 一般来说，在合成培养基中，当重组菌的生 长速率超过某个临界值便产生乙酸。在连续 培养中，当稀释速率超过 0.2h － 1 才能检测到 乙酸的存在。较低的比生长速率虽然产酸少， 但同时对产物表达不利，因此选取合适的比