生物化学讲义20 基因工程及蛋白质工程 考研生物化学精编辅导讲义.ppt

第三部分 分子生物学－信息途径 3 ）聚合酶链反应 ( PCR) 在模板 DNA 、引物、 dNTP 、 TaqDNA 聚合酶等条 件下，体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸 3 个步骤的反复多次循环（ 25 ? 30 次），扩增目的 基因。 第三部分 分子生物学－信息途径 ? 为何酶促反应需要那么高的温度？ ? 为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板 ? 防止非特异性的引物退火 ? 延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度 ? DNA 聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合 酶 第三部分 分子生物学－信息途径 ? 影响 PCR 质量的一些因素？ ? 模板 : 选用纯度较高的 DNA 作模板，杂质蛋白和 RNA 的存在都会影响到 DNA 聚合酶与引物和模板的结合。 ? 目的片断：目的片断或者目的片断相邻的 DNA 含 GC 量较高，或者有重复序列存在，都会导致二级结构 的存在。可在反应体系里加入 DMSO ，破坏模板的二 级结构。 ? 引物的设计：引物太短，要求退火的温度就低，错 配的可能性就大，再者，两条引物不能存在较长的 互补片断 。 ? 酶：纯度、可信度，碱基错配率 1/1000 。 第三部分 分子生物学－信息途径 ? 一些衍生的 PCR 技术 ? 逆转录 PCR (RT-PCR) ? 套式 PCR (nested PCR) ? 反向 PCR(inverse PCR