载体构建作业流程.docxVIP

RNA反转录cDNA 试剂盒：Takara PrimeScript? RT reagent Kit 操作步骤： 提前调水浴锅至42℃； 按下列组份配制 RT 反应液(反应液配制请在冰上进行) 。 5×PrimeScript? Buffer(for Real Time) 2 μl PrimeScript? RT Enzyme Mix I 0.5 μl Oligo dT Primer(50 μM) 0.5 μl Random 6 mers(100 μM) 0.5 μl Total RNA 360ng RNase Free dH2O up to 10 μl total 10μl 轻柔吹打均匀； 室温放置10min； 42℃水浴锅中放置1h； 冰中冷却2min； 上述反应可依据条件在PCR仪中进行。 当需要使用基因编码RNA二级结构较为复杂时,反转录前,将 RNA 溶液于 65°C加热 5 分钟后迅速置于冰中,利用这种措施能够减弱二级结构影响,提升逆转录反应效率。 目标基因扩增引物设计标准： 特异性：在cDNA中能且只能扩增出目标序列，不会扩增出其它序列；（经过blast检验） 在引物5’端添加酶切位点及3个保护碱基； 酶切位点使用所选载体中有位点，尽可能避免使用载体中相邻位点，尽可能避免使用平末端位点；所选位点在扩增目标片段中不能出现，能够使用primer premier对序列中酶切位点进行分析。 PCR反应： 4k以下片段使用KOD Plus DNA 聚合酶，4k以上选择KOD FX DNA聚合酶，按说明书操作； PCR产物回收： 配制1%琼脂糖凝胶：称取一克琼脂糖，加入100ml TAE溶液中，煮沸至凝胶完全溶解。待温度降至60°C左右时(刚好不烫手)加入8μl Goodview，摇匀，将凝胶溶液倒入槽内，冷凝后备用。 将反转录样品和Loading Buffer混匀，加入凝胶孔内，最右端加Marker，固定电压120V，跑半小时左右。此时调水浴锅60°C . 胶回收： 参考意见：500bp以下片段使用2%琼脂糖凝胶；500bp以上使用1%琼脂糖凝胶。标准并不绝对，能够依据个人经验进行调整。 在紫外灯下切下对应大小DNA片段，加入EP管内，根据0.1g凝胶加入100μl百分比加入buffer xp，放入60°C 水浴锅中至胶完全融化。这段时间组装收集管和吸附柱，并在吸附柱上做好标识。 紫外照射时间不宜过长，避免DNA形成TT二聚体。 用大枪将EP管内溶液吹匀，吸入吸附柱中，1 rpm离心1min； 倒掉收集管中废液，向吸附柱中加入300μl buffer XP，最高速（1 rpm）离心1min； 倒掉收集管中废液，向吸附柱中加入700μl wash buffer，最高速（1 rpm）离心1min； 反复上一步骤。 最高速（＞1 rpm）空转2min； 取出吸附柱，放入新离心管中，70℃加热2min，待乙醇挥发； 向吸附柱中加入50μl超纯水，70℃加热2min，1 rpm离心1min，离心管内液体即所需回收DNA溶液。 试剂盒使用OMEGA胶回收试剂盒； 四．PCR产物和载体酶切 使用takara quick cut限制酶，酶切体系及条件见对应酶说明书。 Buffer 5μl Buffer 5μl 酶1 1μl 酶1 1μl 酶2 1μl 酶2 1μl 载体 1μg 外源片段 1μg 水 补至50μl 水 补至50μl 五．连接： 体系中外源片段和载体分子数百分比控制在1:1~1：10之间。对于长约5K载体，通常加入100ng，对于长度为nKb外源片段，加入（20n~200n）ng。体系中其余成分参考对应酶说明书。 六．转化： 超净台内放入小枪，小枪头，大枪，大枪头，1.5mlEP管，固体LB培养基，无抗性液体LB培养基，紫外照射超净台30min，同时调水浴锅至42℃，同时制冰。以下操作如无特别说明，提议均在冰上进行； 从-80℃冰箱内取出感受态细菌，室温融化（能够在手中捂化，不推荐），融化后立即将感受态分装至EP管中，每管约30-50μl，置于冰上； 吸收5-10μl 转化体系，放入感受态中吹打数次，做好标识； 将EP管置于冰上30min； 将EP管置于42℃水浴锅中加热60s（45s-90s之间，自由发挥），期间尽可能不要扰动EP管； 取出EP管，置于冰上2min； 向EP管中加入400~800μl无抗性LB液态培养基，摇床内100rpm，37℃摇45min； 将EP管内培养基倒到固体LB培养基上，晃动培养基，使菌液在