引物设计的几点重要原则.pdfVIP

PCR引物设计的 11 条黄金法则 1.引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。 DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基 因，通过序列分析软件（比如 DNAman ）比对（ Alignment ），各基因相同的序列就是该基因 的保守区。 2. 引物长度一般在 15~30 碱基之间。 引物长度（ primerlength ）常用的是 18-27bp ，但不应大于 38 ，因为过长会导致其延伸温度 大于 74℃，不适于 TaqDNA 聚合酶进行反应。 3. 引物 GC含量在 40%~60%之间， Tm 值最好接近 72℃。 GC 含量（ composition ）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太 大。另外，上下游引物的 Tm 值（ meltingtemperature ）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐 浓度条件下， 50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于 Tm 值 5~10℃。若按 公式 Tm=4 （G+C）+2 （A+T）估计引物的 Tm 值，则有效引物的 Tm 为 55~80 ℃，其 Tm 值最 好接近 72℃以使复性条件最佳。 4. 引物 3 ′端要避开密码子的第 3 位。 如扩增编码区域， 引物 3 ′端不要终止于密码子的第 3 位， 因密码子的第 3 位易发生简并， 会 影响扩增的特异性与效率。 5. 引物 3 ′端不能选择 A，最好选择 T 。 引物 3 ′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为 A 时，即使在错 配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低， G、C 错配的引发效率介于 A 、T 之间，所以 3 ′端最好选择 T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高， 尤其是 3’端相似性较高的序列， 否则容易导致错误 引发（ Falsepriming ）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是 随机的， 不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3 ′端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使 引物在 GC 富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（ Hairpin ）使引物本身复性。 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 引物自身不能有连续 4 个碱基的 互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免 3 ′端的互补重叠以防止引物二聚体（ Dimer 与 Crossdimer ）的形成。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话， 应尽量使其 △G 值不要过高 （应小于 4.5kcal/mol ）。 否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR反应不能正常进行。 8. 引物 5 ′端和中间 △G 值应该相对较高，而 3 ′端 △G 值较低。 △G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性， △G 值越大，则双链越稳定。应当选用 5 ′端和中间 △G 值相对较高，而 3 ′端 △G 值较低（绝对值 不超过 9 ）的引物。引物 3 ′端的 △G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合 反应。 （不同