用酵母双杂交系统的研究蛋白质蛋白质的相互的作用.pptVIP

用酵母双杂交糸统 研究蛋白质-蛋白质 相互作用  蛋白质之间相互作用研究的重要性 蛋白质之间相互作用以及通过相互作用 而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的 主要完成者。 几乎所有的重要生命活动,包括DNA的 复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转 导和代谢等等,都离不开蛋白质之间的相互 作用。  研究蛋白质相互作用的常用方法 酵母双杂交( yeast two hybridization) 亲和层析 免疫共沉淀 蛋白质交联 °基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法 噬菌体显示系统筛选  第一节酵母双杂交糸统简介 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母 中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用 对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过 报告基因的表达产物敏感地检测得到 它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之 间关系的技术。 该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码 的蛋白质之间的相互作用,也可用来研究高等 植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。  、酵母双杂交系统的建立和基本原理 (一)酵母双杂交系统的建立 经典文献出处 Fields s, Song o. a novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature,1989,340(6230):245-246  1989年美国纽约州立大学的Feds和Song首先描述 了酵母双杂交系统 yeast two- hybrid system)。 该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过 程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的 参与,真核生长转录因子含有两个不同的结构域 DNA结合结构域(BD) (NA binding domain) 转录激活因子 转录激活结构域(AD) (activation domain)  这两个结构域各具功能,互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能,只有 两者通过共价或非共价键连接建立起来 的空间结构方可表现出一个完整的激活 特定基因表达的激活因子的功能。  Ga4为酵母半乳糖苷酶基因gl的转录激活 因子,天然的Ga4分子是由一条由881个氨基 酸残基组成的多肽链。 两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的 147位多肽构成,能识别位于Ga4基因的上 游激活序列 upstream activation sequence UAS)。 此外,在其N-端还具有一段核定位序列。 AD由位于C末端的768~881位多肽构成。 当Gal4的两个结构域位于不同肽链上,只要 它们在空间上充分接近,则能恢复Gal4作为转 录因子的活性。  Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭 质粒上,一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白 SNF1融合;另一个是将Ga4的AD和酵母蛋白 SNF4融合。 其中,SNF1是一种丝氨酸苏氨酸的蛋白激 酶,SNF4是它的一个结合蛋白,这两种蛋白是 已知可以相互作用的。  当两种穿梭质粒共转化含有Ga4结合位点的报 告基因LacZ的酵母菌株后,通过SNF与SNF4的 相互作用,Ga4的DNA-BD与Gal4的AD靠近,形 成一个大的复合物Gal4 D-SNFI-SNF4Ga4AD。 Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的 UAS,并可与之结合; Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合, 激活UAS下游报告基因LacZ的转录