双缩脲法测定蛋白质含量.pdfVIP

实验二十 蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量 一、实验目的 学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。 二、实验原理 在碱性溶液中，双缩脲 (H2N-CO-NH-CO-NH2) 与二价铜离子作用形成紫红 色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基 (— CO-NH2) ，或与此相似的基团 [ 如—CH2-NH2 ，—CS-NH2 ，—C(NH)NH2] 的任何 化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连， 均可发生上 述反应。蛋白质分子含有众多肽键 (— CO-NH —)，可发生双缩脲反应，且呈色强 度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比， 可用比色法测定蛋白含 量。测定范围为 1～10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、 Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速， 不同的蛋白质产生颜色的深浅相近， 以及干扰物质少。 主要的缺点是灵敏度差。 因此双缩脲法常用于快速， 但并不需要十分精确的蛋白 质测定。 三、实验试剂和器材 [试剂 ] 1．双缩脲试剂： 取 CuSO4 ·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠 (c.P.)6.0g 以少量 蒸馏水溶解，再加 2.5mol ／L NaOH 溶液 300ml ，KI 1.0g ，然后加水至 1000ml。 棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2 ．标准蛋白质溶液： 用标准的结晶牛血清清蛋白（ BSA ）或标准酪蛋白， 配制成 10g/L 的标准蛋白溶液，可用 BSA 浓度 1g/L 的 A280 为 0.66 来校正其纯 度。如有需要， 标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量， 计算出 其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl 配制，酪蛋白用 0.05mol/L NaOH 配制。 [器材 ] 1．试管： 15×150mm 试管 7 只； 2 ．1ml，5ml 移液管； 3．坐标纸 ； 4 ．721 分光光度计。 四、实验操作 取试管 7 支，编号，按下表操作： 试剂 空白管 1 2 3 4 5 测定管 管号 蛋 白标 准 - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 – 液（10g/L） 生理盐水 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 - 0.4 待测样品 - - - - - - 0.1 双缩脲试 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 剂 相当蛋白 0 10 20 30 40 50 - 质（ g/L ） 混匀， 37℃水浴 20 分钟，冷却至室温，在分光光度计波长 540nm 处，用空 白管调零，读取各管吸光度值。 1～5 为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度 为纵坐标， 蛋白质浓度为横坐标