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.iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu DNA凝胶电泳DNA agarose gel electrophoresis 实验七 .......... * 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品,其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 实验原理 .......... * 实验材料:PCR产物,植物基因组DNA,质粒DNA等,购买 或自行提取纯化。 实验试剂: 5×TBE电泳缓冲液: 6×电泳载样缓冲液:0.25% 溴粉蓝,40%(w/v) 蔗糖水溶液,贮存于 4℃。 溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10 mg/mL,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。 实验材料和试剂 .......... * 微波炉 实验仪器 .......... * 凝胶电泳槽 .......... * 凝胶成像系统 .......... * 实验步骤 取5×TBE缓冲液20mL加水至200mL,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。 胶液的制备:称取0.4g琼脂糖,置于200mL锥形瓶中,加入50mL 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。 胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。 .......... * 加样:取10μL DNA样品与2μL 6×上样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 电泳:加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 染色:未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/mL的EB溶液中,室温下染色20-25min。 观察和拍照:在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。 .......... * 琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1、 DNA的分子大小 2、 琼脂糖浓度 3、 DNA分子的构象 4、 电源电压 5、嵌入染料的存在 6、 离子强度影响 .......... * .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu .iuu ... ....
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