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双抗原夹心法的反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。 双抗原夹心法 .......... * 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。 间接法 .......... * 除了以上常见的4种检测方法外，还有直接法、捕获包被法、竞争法（测抗体）、双抗原夹心法、ABS-ELISA法等其他方法。 .......... * ELISA实验过程主要分以下三步： 第一：实验设计 1.了解将要测定的样品属于什么类别，选用最佳的ELISA检测方法； 2.选用正确的阴性对照品、阳性对照品、样品标准品等； 3.规划实验中所使用各种试剂的浓度、加入量、反应时间等； 4.再细化实验中每个步骤的开展时间，合理的时间安排能使实验有条不絮的进行。 第二：实验准备 1.实验所使用物料的清点； 2.实验试剂的配备； 3.实验仪器的预约； .......... * 第三：实验操作（以双抗体夹心法为例） 1.包被（在聚苯乙烯板上包被特异性已知抗体，使之与板结合） 4℃过夜（大于12小时）或37℃孵育2小时，包被后洗涤一次； 2.封闭（一般使用0.1~2%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清等）37℃反应2小时（封闭液体积要大于包被液体积），封闭后清洗3次； 3.加入含有待测抗原的样品，37℃孵育1小时； 4.洗涤，清洗3次； 5.加入酶标液（酶标二抗），37℃孵育1小时； 6.洗涤，清洗5次； 7.加入酶促反应底物，发生显色反应（37℃避光显色5~15min)，终止显色后测量450/630nm吸光值。 注：上面实验共12次清洗，清洗次数可适当增多，同一反应尽量保证使用同一种清洗液，常见清洗液有PBST、TBST、PBS等。 .......... * 结果判定 定性测定 定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。 待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者为阳性，N为阴性对照孔。 定量测定 .......... * 实验中使用的试剂、仪器 常用试剂： 1.包被缓冲液：0.05M PH 9.6 碳酸盐缓冲液、0.1M PH 9.6 碳酸盐缓冲液、pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL 缓冲液等。 2.封闭液：0.1~2%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清等（一般溶于0.15M PBS中）。 3.洗涤液：PBS、PBST、TBST等。 4.抗体稀释液：PBST、0.5~2%BSA（溶于PBST中）等。 5.底物缓冲液：TMB显色液、OPD显色液、ABTS显色液、AP显色液等，根据所使用的酶标抗体选用对应的底物缓冲液显色。 6.终止液：2M硫酸。 .......... * 常见仪器 单孔道、多孔道移液器 振荡器 洗板机 酶标仪 计时器 .......... * 实验中遇到常见问题与解决方法 1.阴性对照出现阳性结果： 　　　造成该现象的原因有4个： 1）试剂或样品可能被污染，或者由于孔之间的溅洒出现交叉污染。 ——应当更换使用试剂，小心操作； 2）酶标板洗板不彻底。 ——尝试用洗液充满板孔确保每孔被充分洗涤，洗板前确保所有的剩余抗体溶液被倒净； 3）抗体量过多导致非特异结合。 ——应该根据推荐用量使用抗体，尽量使用较少的抗体； 4）夹心法、捕获法中检测抗体与包被抗体/抗原反应。 ——确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体，两者之间不会互相反应。 .......... * 2.酶标板整体背景高 　　　造成该现象的原因有4个： 1）抗体非特异性结合。 ——应确保进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液，最好使用5%~10%的与二抗同种动物来源的血清或牛血清，确保板孔经过预处理以防止非特异结合，使用亲和力强、纯度高的抗体，最好经过了预吸收处理； 2）底物结合浓度过高或反应时间过长。 ——应调整底物的浓度，当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应，适当缩短显色时间； 3）底物溶液不新鲜或被污染。 ——应检测底物溶液，正常的底物溶液应该是清亮透明的，如果变黄或其他颜色则是被污染的标志； 4）底物孵育过程没有避光。 ——底物孵育应该在避光环境下进行。 .......... * .......... .iuu .iuu .iuu .iuu .iu