植病研究法---细菌病害的研究法资料.ppt

2．常规接种技术 （1）接种物的准备 繁殖的细菌一般都配成悬浮液接种，有时也可直接用来接种。至于测定菌系致病性的强弱和比较品种抗病性的差异等，则规定一定的浓度为妥，浓度太低有时接种不易成功。针对不同的病原细菌和实验的要求，经过实践确定适当的浓度，一般可用每毫升含3亿个细菌(3×l08CFU/m1)的菌液。接种用的细菌要注意菌龄，菌龄老则细菌致病力显著减退，接种后甚至不发病。 ;.; * (2)各种类型细菌病害的常用接种方法 [1]叶斑病和叶枯病的接种 叶斑和叶枯是最常见的细菌病害，接种的方法很多，但不外乎使细菌从伤口或气孔等自然孔口侵入叶片。由于植物病原细菌不能从表皮直接侵入，也不像真菌那样以孢子萌发形成的芽管从气孔侵入，因此要求在接种的时候就有较多的细菌进入气孔内。 针刺接种 喷雾接种 高压喷雾接种 摩擦接种 接种方法 ;.; * 1)针刺接种  针刺接种是很有效的接种方法，为了测定分离到的细菌的致病性，一般都先试用这种方法。比较简单的办法是：用接种针从琼胶斜面上挑取少许细菌直接穿刺叶片接种。为了提高接种效率，可以将许多针固定在橡皮塞或软木塞上，蘸取细菌悬浮液接种，一般称为多针接种法。针刺接种后的植物，不一定要求保湿，但有时保湿的效果要好一些。 ;.; * ;.; * 2.平板划线分离法 取小块病组织，经过表面消毒和灭菌水洗过2次以后，放在灭菌载玻片上的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎。静置一定时间，用灭菌的移植环蘸取以上组织液在琼胶平板上划线培养; 先在平板的一侧顺序划3～5条线，再将培养皿转60°将移植环灭菌后,从第二条线末端，顺序划出3-5条线。目的都是使细菌分开形成分散的菌落。 ;.; * 划线分离法的关键是要等到琼胶平板表面的冷凝水完全消失后才能划线，否则细菌将在冷凝水中流动而影响形成单个分散的菌落。为了加快消除冷凝水，可以将培养皿在37℃的温箱中放一二天，或者在无菌的条件下，将培养皿的盖打开，翻转培养皿斜靠在盖上，在50℃的干燥箱中干燥30min。 ;.; * ;.; * 植物病原细菌的分离还需注意： [1]分离材料新鲜 要从新鲜的标本和新的病斑分离。存放太久的标本，其中病原细菌的生活力减弱，而腐生性细菌则滋长很快，从这种组织分离到的大都是腐生菌。 分离用的标本最好是夹在吸水纸中邮寄，放在塑料袋中保湿是不适宜的。 标本保存的时间较长而不容易直接分离成功，可以经过接种后再分离.例如，分离软腐病细菌时，由于腐烂组织中往往杂有大量的腐生菌，可以挑取少许腐烂组织针刺接种在相应的健全组织上，发病以后再从接种的组织上分离。 ;.; * [2]适宜的培养基 分离失败的原因，有时是由于培养基不适宜。一般来说，寄生性细菌对培养基的要求要比腐生性细菌严格。同时，一种适宜于纯培养的培养基(细菌群集没有其他杂菌干扰)，不一定适宜于分离(细菌分散而单独存在，同时还可能有杂菌干扰)。 因此，分离时要选用适当的培养基，有时要用选择性培养基。但有时失败的原因不是培养基的成分不适宜，而是由于培养基的酸度不适当或存放的时间太长。因此，在灭菌后和使用前，最好是再核对一下培养基的酸度。 ;.; * 二、分离培养基 （1）通用培养基: NA培养基 （2）属和种的选择性培养基 [1]土壤杆菌属(Agrobacterium) 一般是用甘露糖醇培养基 甘露糖醇 15g 硝酸钠(NaNO3) 5g 硝酸钙[Ca(NO3)z·4Hz0 320mg 磷酸氢二钾(K2HPO4) 2g 氯化锂(LiCl) 6g 硫酸镁(MgSO4·7H20) 0.2g 溴百里酚蓝 0.1g 琼胶 15g 蒸馏水 1000ml 灭菌后酸度是pH7.2，培养基呈深蓝色。土壤杆菌属细菌的菌落圆形、凸起、发亮，最初浅蓝色，以后深绿色。溴百里酚蓝抑制革兰氏反应阳性的细菌，氯化锂抑制假单胞菌属细菌。以上培养基，已有选择性培养基的作用，以甘露糖醇作为碳源是它的特点。 ;.; * [2]假单胞菌属(Pseudomo