原核表达遇到瓶颈怎么办.pdfVIP

我想表达遇到的第一个瓶颈估计就是为什么我的外源片段插到 载体里面， PCR鉴定没问题，双酶切也 OK，可是就是不见表达。 一般我们是如何判断没有表达呢？大多都是首先进行 SDS。 在跑胶的时候一定要设对照 ，比较严谨的电泳对照， 应该是： Marker ，标准品阳性对照（如果有，且打算做 Western 的话）， 以及空白载体（诱导）和重组载体（不诱导） 2 个阴性对照，再 加上诱导不同时间的表达结果。 Marker 用于判断条带大小， 标准 品用于判断 Western 体系包括抗体显色剂和操作的可靠性，以及 精确判断大小；空白载体（诱导）负对照有助于判断在非诱导条 件下的本底表达；而重组载体（不诱导）负对照则有助于判断诱 导的效果以及排除诱导剂对宿主菌潜在的干扰，或者是区分细菌 内源和外源表达产物——偷懒可不是好习惯，会影响结果判断。 注意，接种表达和接种做感受态都类似，一定要用挑单克隆、加 足量抗生素、过夜培养的新鲜菌液转种最好，在筛选压力下生长 旺盛的种子液远比经过 4 ℃保存的菌液要好得多，也许是因为保 存时间长会导致抗生素失效部分细菌丢失质粒或者其他变化。反 正 就 是 一 种 经 验 做 法 。 跑 SDS的话可以用 考马斯亮兰染 ，它灵敏度在 100ng 左右； 但是不能跟着做 Western 了。银染的灵敏度在～ 1 ng ；有钱还可 以用 Sypro Red ，灵敏度高还可以继续做 Western 。WesternBlot 是蛋白质定性和半定量的最通用的技术，具体细节可参考生物通 We s t e r n B l o t 技 术 专 题 ， 我 们 有 详 细 介 绍 的 。 在做过 Western Blot 仍没有检测到表达带，那么就要开始进行 下一步的分析了。首先，看看载体的多克隆位点和片断插入的序 列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。有时载体 几经多个实验人员的周转，反复插入片断，或者是粘端相同的不 同酶切片断之间的连接，会意外在启动子后面带入终止位点，特 别是用到 XbaI 之类的酶要小心。然后要对测序结果进行确定， 确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。还有个 大家容易忽略的问题：就是要看基因中有没有细菌不常用的密码 子——如果有，需要考虑换表达菌株。每种菌株都有自己独特的 设计，或者是 蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是 为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。 不同 的载体要配合一定的菌株使用，像 pET 系列就一定需要有 T7 RNA 聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。采用不同调控机 制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调 控方式再换。以 Novagen 为例，如果使用 BL21(DE3)表达不成功 的话可以换 Rosetta 系列菌株，它能够由一种氯霉素抗性的、与 pET 相容的质粒提供 AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和 GGA 的 tRNA。 所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的 表达限制。有时不明原因的表达蛋白截短（比预期的分子量要小 很多）也可能是由于稀有密码子造成的。另外一种可能是不严谨 的本底表达产物抑制。 没有发现原则性错误之后，最简单、快捷的就是改变一下表达温 度、 IPTG 浓度。低温、较长时间的表达有利于蛋白