淋巴细胞培养技术.docxVIP

一、苜蓿多糖对淋巴细胞的影响 1材料与试剂 1.1动物 小白鼠 1.2材料 苜蓿多糖、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、 96孔细胞培养板、 四甲基偶氮哩盐(MTT)、台盼蓝、尼龙毛、 1.3试剂配制 1.3.1 RPMI-1640 培养基配制 100 U/mL 青霉素、125四/mL 链霉素 将RPMI-1640干粉袋中的粉末用力往下甩，开口倒出粉末，量取 800mL的三蒸水， 先冲洗袋子至干净，然后加入 2 g NaHCO 3,搅拌定容至1000 mL，调pH值为7.1-7.3。 过滤除菌，放于-20oC储存。 1.3.2胎牛血清 将冷藏的胎牛血清放在 4 °C,使之融化一半，然后室温放置使其完全融化。 56 C水 浴30 min将其灭活，分装到 15 mL的离心管中，-20 C保存备用。 1.3.3 pH7.2 PBS 缓冲液 准确称取 8.0 g NaCl , 0.2 g KCl , 2.925g Na 2HPO 4 12H2O , 0.2g KH 2PO4,用 三蒸水溶解，然后用 HCl (1 mol/L )调pH值至7.2，加水定容至 1000 mL , 120 C高压 灭菌，4 °C保存备用。 1.3.4红细胞裂解液 称取 NH4Cl 4.16 g , KHCO 3 0.5g , Na2EDTA 0.02g，溶于 100 mL 蒸储水中，调 pH 7.2，加水至 500mL，存于 4oC。 1.3.5 MTT作用液 称取50 mg MTT （3- （4, 5-二甲基嚷哩-2） -2 , 5-二苯基四氮哩漠盐，商品名：坐 蓝。是一种黄颜色的染料。 ），溶解在10 mL PBS 中，0.22 的滤器过滤除菌，4C避 光保存。（MTT有致癌性，用时需戴透明 PE手套） 2（1 ） T、B淋巴细胞制备： 颈椎脱臼法处死，用 75%酒精消毒，浸泡1-2 min,在超净工作台中取出脾脏，用 灭菌生理盐水冲洗 3次，剔除脂肪和结缔组织，置于含 D-Hanks （相当于生理盐水）无菌 培养皿里，放入含 D-Hanks液的平皿中用灭菌的剪刀、镶子把器官剪碎，在 200目的细胞 筛网上挤压研磨过滤，收集细胞悬液。将 Percoll分层液1 mL加到10 mL试管中，缓慢贴 壁把以上淋巴细胞悬液加到分层液上面， 把试管用橡皮塞塞紧，以3000 r/min 离心15 min ; 后用移液管吸出淋巴细胞，用完全 RPMI-1640洗2次，倒出上清，再准确加 5 mL完全 RPMI-1640培养液，用枪头吹吸使之混匀，计数板显微镜下计数；计数以后以 1000 r/min 离心5 min ;离心以后弃去上清液，加适量的完全 RPMI-1640培养液将细胞调成 2刈07个 mL-1，并用台盼蓝染色检测细胞活力大于 95% ,即得到淋巴细胞培养液。 T、B淋巴细胞的纯化[1]: 尼龙棉以0 .2 mol/L HCl浸泡6 h，再用大量蒸储水反复冲洗， 晾干。称取尼龙棉50 mg, 将其仔细撕开装填入 10 mL注射器内，高压灭菌。尼龙棉柱高度为 6 cm ,可有效地过滤 （2~3 ） x 107个细胞。用 D-Hanks液和RPMI-1640 （含10 % 胎牛血清）培养基洗柱各 2 次，以平衡pH、温度、排除空气，37 C放置1 ho上柱前，先将平衡液放出，垂直滴加入 淋巴细胞悬液0.5 mL ,平放尼龙棉柱， 以细长的毛细滴管伸入柱内界面加入培养液 0.5 mL 封口，将柱于37 °C静置孵育1 h，用预温的培养液淋洗柱 2~3次，流速控制在1 mL/ min , 收集最初的10 mL流出液，1300 r/min离心10 min，此即分离的纯化 T淋巴细胞。再用 培养液边洗脱边挤压尼龙毛柱， 用钢针缓缓从上至下挤压尼龙棉， 使柱中细胞挤出，收集 的洗脱液是B淋巴细胞，1300 r/min离心10 min，此即分离的纯化 B淋巴细胞。 流式细胞术测定 T、B淋巴细胞纯度：取 2个流式上样管，其中 2管为纯化前的脾 细胞悬液对照组，用于测定分选前 T、B细胞含量，另外2管为纯化后的T、B淋巴细胞样 品组，用于测定分选后 T、B细胞含量。向各管中分别加入 5 X105个脾细胞或 T、B淋巴 细胞，并在管中补入含1% FBS的PBS溶液，使得各管总体积为 0.5 ml, 4 °C条件下1000 rpm X 5 min离心，然后小心倾倒上清，向管底相应加入小鼠Anti-CD3-FITC 或 Anti-CD19-PE 荧光标记抗体 100状/管(含荧光标记抗体原液 1山，轻微震荡混匀，避光 反应30 min。每管加入0.5 ml含1% FBS的PBS再次洗涤细胞，倾倒上清，加入 0.5 ml 含1% FBS的PBS缓冲液重悬细胞，锡箔