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三聚氰胺的样品前处理及最新 LC-MS检测方法 三聚氰胺的样品前处理及最新 LC-MS佥测方法：ASB亲 水色谱柱 北京艾杰尔科技有限公司 开发的三聚氰胺的样 品前处理及最新LC-MS佥测方法：ASB亲水色谱 柱 三聚氰胺的样品前处理及最新检测方法 本文采用固相萃取法对样品进行前 处理，并对比了不同的检测方法 ，包括FDA公布的检测 方法〔 1〕对三聚氰胺分析的影响。 2.2 试剂与样品 宠物饲料样品 （农业部饲料供应中心提供） ； 甲醇、乙腈为北京艾杰尔科技有限公司提供；氨水、 乙酸铅、三氯乙酸、均购于北京化学试剂公司；三聚 氰胺标准品、柠檬酸、辛烷磺酸钠（ Sigma公司）；甲 醇为色谱纯，其他均为化学纯。 3 实验方法 3.1 样品前处理方法 （1） 标准样品配制： 取50mg^聚氰胺标准品，以20%甲醇溶解定 容至50mL得到lOOOppm的标准溶液，使用时， 以提取液 （0.1%三氯乙酸 ）稀释至所要的浓度。 （2） 提取： 称取饲料样品5g,加入50ml 0.1%三氯乙酸 提取液，充分混匀，加入2mL2%乙酸铅溶液，超声20min。 然后取部分溶液转移至 10mL离心管中，8000rpm/min离 心10min，取上清液3mL过混合型阳离子交换小柱 （PCX）。 （3） 净化（PCX小柱，60mg/3mL）: a） 活化及平衡：3mL甲醇，3mL水 b） 上样：加入提取液 3mL c） 淋洗：3mL水; 3mL甲醇；弃去淋洗液并 将小柱抽干。 d） 洗脱： 5mL 5%氨化甲醇 （v/v） 洗脱。 （5% 氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇）。 e） 浓缩：50C,氮气吹干，20卿醇/水定 容至2mL, HPL（分析或衍生后GC/MS析。三聚氰胺检 测中样品前处理方法的比较 农业部行业标准 NY/T 1372-2007b 5 g 饲料 50 mL 三氯乙酸（ 1%）， 2mL 乙酸铅（ 2%）， 超声波振荡萃取20 min，静止2min。取上层提取液约 30mL 转入离心试管， 10000rpm 离心 5 min 。 国家乳制品质检中心 GR/T 0004-2008 c 5 g 试样 方法一、 50 mL 三氯乙酸，超声波振荡萃取 30 min 。 加5 mL乙酸锌（2%，用三氯乙酸溶液容 100 mL,滤 纸过滤。 方法二、50 mL50%L腈水溶液，超声波振荡萃取30min。 用0.1 M 盐酸定容至100 mL,滤纸过滤。 艾杰尔公司方法 d5 g 饲料或 10 mL 牛奶 50 mL 1%三氯乙酸，2 mL乙酸铅（2%，超声20min。 取部分液体8000 rpm离心10 min。取上液供SPE萃取。 瓦里安公司方法 e5 g 饲料或 10 mL 牛奶 24 mL 乙腈 /水溶液（ 50:50， v/v ）, 1 mL1.0M 盐酸, 振荡 30 sec，蜗旋振荡 1 min, 4000rpm , 5oC 离心 5 min。 0.45m过滤。 前处理方法比较 上述五个方法中，按照时间先后，最早是方法 A,其次 是方法B方法D、再其次是方法C和D。其中方法D除 了采用瓦 里安的固相萃取柱外,其萃取及净化方法与方法 A 完 全相同。应该说,其他方法都是基于方法 A 产生的。 萃取方法： 在上述六种萃取方法中（其中方法 C 有两种萃取方 法）,除了方法 C 中的萃取方法二,其余都是将三氯 氰胺萃取至酸性水溶 液中。而方法 C 中的萃取方法二是先进行中性萃取, 然后再将萃取溶液调节至酸性。三聚氰胺属于弱碱性 化合物,根据美国国家药学图书馆（ United States National Library of Medicine ）的数据,其 pKa = 5。 因此，应该在酸性条件下（pH 3 , pH至少低于三聚 氰胺pKa两个pH单位）将三聚氰胺萃取至水溶液中。 由于在三聚氰胺在酸性条件下呈阳离子状态,便于固 相萃取净化时采用阳离子交换柱吸附。 方法 B、 C、 D 中 均加入了乙酸盐,与三氯乙酸形成缓冲溶液,以减少 pH 的波动。 固相萃取净化： 上述五种方法中,固相萃取净化采用的均为混合型阳 离子交换柱,其中方法 A、 D、 E 中采用的均为高聚物 为基质的亲水 - 亲脂混合型阳离子交换柱。 Oasis MCX和Cleanet PCX 柱的阳离子功能团为苯磺酸基, Bond Elut Plexa PCX 柱的阳离子交换功能 团属性无数据可查。苯磺酸基属于强阳离子交换功能 团,在任何 pH 条件下都呈带负电荷的阴离子。因此, 只要控制样品溶液的 pH 使三聚氰胺呈阳离子状态, 就能够被苯磺酸基通过 离子交换方式吸附。而在上述溶液萃取中,三聚氰胺 已经是在酸性条件 下,所以是呈阳离子状态,可以被苯磺酸基吸附