小鼠肝组织RNA提取及RT PCR实验课件.ppt

小鼠肝组织 RNA 提取及 RT- PCR 实验 一、试剂及材料 1 、小鼠肝脏 2 、 DEPC 处理过的 EP 管、 PCR 管 3 、 Trizol 、氯仿、异丙醇、 DEPC 水 二、实验原理 TRIZOL ：异硫氰酸胍 + 苯酚 裂解细胞， RNA 与蛋 白质分离，将 RNA 释 放到溶液中。 促使 RNA 进入水相， 离心后可形成水相 层和有机层。 RNA 与仍留在有机相中的蛋白质和 DNA 分离开。 水相层（无色）主要为 RNA ，有机层（黄色）主 要为 DNA 和蛋白质。 三、实验步骤 RNA 提取 1 、新鲜肝组织置 EP 管中，加 200 ? l Trizol 充分研磨后，补加 800 ? l Trizol ，枪头吹匀。 2 、加入 200 ? l 氯仿，剧烈震荡 15 秒， 4 ℃ 12000g 离心 15min 。 3 、将上层水相移至洁净 EP 管中，加入 500 ? l 异丙醇颠倒混匀。 4 、 4 ℃ 12000g 离心 10min 。 5 、弃水相， EP 管开盖干燥，溶于 50 ? l DEPC 水中。 RT-PCR ： RNA 的反转录 + cDNA 的 PCR RT-PCR 操作步骤 5x Prime Script Buffer 2 ? l ① Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 ? l ② Oligo dT primer (50 ? m) 0.5 ? l ③ Random 6 mers (`100 ? m) 1 ? l ④ 提取的 RNA 0.5 ? l RNase Free 水 5.5 ? l ⑤ 37 ℃ 15min 85 ℃ 5 sec 10 ? l PCR 10x PCR Buffer 5 ? l dNTP 4 ? l 模板 DNA 2 ? l 引物 1 2 ? l 引物 2 2 ? l Taq 酶 0.5 ? l H 2 O 34.5 ? l 50 ? l