分子克隆常用的载体.pptxVIP

Cloning Vectors;二、基因工程的基本程序;第六章?????? 分子克隆常用的载体;第一节??????? 质粒载体;一、质粒的基本特性;二、质粒的分离纯化方法; 质粒的存在形式：呈共价闭合环状 ①超螺旋的SC构型 （cccDNA） ②松弛开环的OC型 （ocDNA） ③松弛线性的L构型（cDNA） 基本步骤： 细菌生长和质粒的扩增 菌体收获和溶菌 质粒纯化;氯化铯浮密度分离法; 碱变性法抽提质粒DNA;三、质粒载体的选择;四、大肠杆菌质粒载体;五、多种功能的衍生质粒的组建 ;带有不同种类抗性基因的质粒载体;pAT153是由pBR322质粒改造而成，这种质粒的拷贝数比pBR322高1.5～3倍。它的大小是3.6kb,选择标记有氨苄青霉素抗性基因Ampr和四环素抗性基因Tetr、单一切点的限制性内切核酸酶有PvaⅠ、PstⅠ、BamHⅠ、ClaⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ。;正选择质粒;第二节??????? 噬菌体载体;烈性噬菌体 温和噬菌体 溶源化细菌 溶源化 原噬菌体;二、λ噬菌体载体;（二）λ噬菌体的类型 插入型载体 替换型载体 ( 三 ) λ噬菌体载体的应用 1.转染作用 转染：由宿主细胞捕获噬菌体或病毒DNA的过程。 转导：以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。 转化：质粒等外源DNA引入细胞的过程。 2. λ DNA的体外包装 ;（四） 常用λ噬菌体 凯伦噬菌体载体 这类载体有插入型的，如Charon2；也有替换型的，如Charon30。在基因操作中用途很广。 Charon载体上具有适当数量的限制酶切位点，带有来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ（中央区段）。插入基因经包装后，可通过蓝/白斑筛选阳性克隆。 Charon载体的特点是容量大，对研究大范围内的染色体结构很有用处。;三、粘性质粒;在酵母细胞中常用的载体的共同特点;第三节??????? 真核细胞的克隆载体;整合型载体（YIP）;复制型载体（YRP）;附加体型载体（YEP）;载 体 载体（Vector）：能携带外源基因导入受 体细胞，这种运载工具称载体。 1.克隆载体: 具组装、复制、扩增功能。如：pBR322、pUC18/19等。 2.表达载体: 不仅具组装、复制、扩增功能，还有转录表达功能。如：pBV220、pKK223-3 3.载体的种类：质粒、噬菌体衍生物（COS、M13）、动物病毒。 ;共同特征： ①自主复制 ②易于扩增分离纯化 ③有非必需区 ④有单一酶切位点（多克隆位点） 单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点 多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点 ⑤有选择标记基因 ⑥有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列） ;质粒;种类： F质粒：使宿主染色体上的基因随其一起 转移到原先不存在该质粒的受体细胞中。 R质粒：抗性因子，携有一种或多种抗生素抗性基因 Col质粒：有编码大肠杆菌素基因;质粒的类型和特性;特性： CopA和CopB基因 1.复制： 负调控 RI质粒：repA基因表达 复制 PSC101 ：正调控 是由ori复制子向左单向复制 2.不相容性；在同一细胞中，同类质粒不能并存的现象。PUC18 PUC19 分配功能：质粒复制后，随细胞分裂的进行，质粒分配到子细胞中。 ;Triton和PEG化学提取法;煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质粒DNA ;多功能质粒-PUC质粒;插入型载体 ;替换型载体;单链DNA噬菌体载体;三、动物细胞基因克隆的载体;SV40病毒 ;(1)取代型重组病毒载体 ;(2)重组的病毒-质粒载体 ;①晚期区段取代载体 ;②早期区段取代载体 ;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;