实验一 有丝分裂制片技术.ppt

实验 有丝分裂制片技术和显微观察 实验目的 通过对植物组织的取材、预处理、解离、染色、压片等步 骤的学习,掌握植物制片技术,为进行细胞遗传学的研究奠定 基础。通过对植物根尖细胞的观察,掌握有丝分裂过程染色体 的形态特征和动态变化。 二、实验原理 各种生长旺盛的植物组织如根尖组织、茎尖 组织,居间分生组织,愈伤组织常常进行着细胞 分裂。有丝分裂是植物主要分裂方式,通过细胞 分裂,使细胞核内染色体准确地复制,并有规律 地,均匀地分配到两个子细胞中去,使子细胞和 母细胞的遗传组成一样。在细胞分裂的适当(分 裂旺盛期)时候取材,进行预处理,固定、解离 染色和涂抹压片等方法,可以使细胞和染色体 散,便于在显微镜下观察染色体的形态特征和染 色体的变化特点,并进行染色体计数。 实验材料 蚕豆( Vicia fab,2n=12)干种子 洋葱( Allium cepa,2n=16)鳞茎 四、实验仪器及用具 多媒体系统(带显微演示)、显微镜、培养箱、分析天 水浴锅、酒精灯、剪刀(或刀片)、镊子、解剖针、载玻片 玻片滤纸、铅笔、标签纸、胶水 五、药品和试剂 秋水仙碱、8一羟基喹啉、苏木精、水合三氯乙醛、铁矾[铁钾 矾KFe(SO4)212H2O或铁铵矾NHFe(SO)212H2O]、无水酒精 冰醋酸、1N盐酸、50%丙酸 六、实验步骤 )材料准备 1.蚕豆根尖:选取新鲜无病斑的蚕豆干种子,经日晒后 放在烧杯内清水室温浸泡一昼夜。种子吸水膨胀后,放在搪瓷盘 上20℃左右保湿培养(双层纱布覆盖),待根长1-2cm时,于 午9:00-10:30或下午14:00-16:00进剪下根尖备 2.洋葱根尖:通过休眠的洋葱鳞茎,根部经阳光晒后,置 于盛有清水的小烧杯上,根茎部与水接触,20-25℃光照条件 养2-3天,待根长1-2cm时,于上午9:00-11:00剪下根尖备 二)预处理 为了获得较多中期分裂相的细胞,同时使染色体缩短和分散 可对根尖进行预处理,处理方法如下 1.0.05%-0.2%的秋水仙碱水溶液处理2-4小时。 2.0.002M8-羟基喹啉溶液处理3-4小时, 3.1-4℃低温对浸入蒸馏水中的根尖处理24小时 )固定: 预处理的材料经蒸馏水冲洗干净后,用卡诺氏(冰醋酸:无水酒精 3)固定液室温下固定30-60分钟,固定液量应为材料体积的15倍 定材料如暂不使用,可经90%酒精→80%酒精→70%酒精各半 小时浸泡转换,最后用70%酒精置0-4℃冰箱保存半年。如保存时间太 长,需重新固定后再用 (四)解离 根尖和和茎尖等体细胞需经处理,除去细胞间的果胶层,并使细胞 壁软化,才便于压片。这种处理方法称为解离,解离时间的长短依植物 材料和解离液而不同。时间短细胞不易压散,时间过长,细胞被压破 且影响染色效果 方法1:固定的材料(洋葱或蚕豆根尖)用蒸馏水冲洗2遍,然后放 入预热的60℃的N盐酸中,60℃恒温处理5分钟左右,倒去盐酸,用蒸 馏水冲洗3遍后,将材料浸泡在蒸馏水中2小时, 方法2:固定的材料、用蒸馏水冲洗干净后,置1N的盐酸中,蚕豆 根尖在室温(约28-30℃)处理30分钟左右,洋葱根尖室温处理15分钟 右。然后倒去盐酸,蒸馏水洗3遍后,置于蒸馏水中浸泡2个小时以上。 将材料中的酸洗净。 方法3:取蚕豆根尖,在生长点处切取1毫米左右(一般一个根尖 取4-5段),放入 IN HCI酸解10分钟左右。取出,用水漂洗三遍 载玻片上。 (五)染色液和制片 1染色液 (1)丙酸一铁矾苏木精 贮存组:A液:苏木精2克,溶于100m150%丙酸 B液:铁钾矾0.5克溶于100ml50%丙酸 染色液:A液和B液等量混合,每5m的A液和B液的混合液中加入2克水 合三氯乙醛,充分溶解摇匀,存放一天后使用。贮存液可较长久保存 染色液只能保存一个月,在两周内使用效果最好。 (2)改良卡宝品红 甲液:3克碱性品红,溶于70%酒精100ml(可长期保存) 乙液:甲液10m,加入5%苯酚(石炭酸)水溶液90m(限2周内使 染色液母液:B液45ml, 冰醋酸6ml。 改良卡宝品红染色液:染色液母液10ml, 45%醋酸90ml, 梨醇1克 配制后立即使用着色能力差,两周后着色能力增强。 制片 选(挑)取根(茎)尖一枚,放在干净载玻片中央,除去非分生组织的部分 并吸去多余水分。另取一张干净载玻片,呈十字形交叉盖在有根尖的载玻片 大拇指按压在载玻片的中央,使根 尖压成一簿层,然后将两载玻片分开 各滴一小滴上述染色液进行染色,稍等片刻,取一盖玻片,盖玻片一边靠在离材 料不远的载玻片上,左手握镊子顶着盖玻片,右手握解剖针托住盖玻片徐徐放下 若染色液不能布满盖玻片时,可在盖玻片边缘稍加染色液,然后用一张大小合适 的滤纸覆盖在盖玻片 固定盖玻片,另一手持铅笔橡皮头,对准材料