新型抗菌肽Anoplin的N-甲基化氨基酸替换和N端脂肪酸修饰类似物的设计及构效关系研究.pdf

新型抗菌肽Anoplin 的N-甲基化氨基酸替换和N 端脂肪酸 修饰类似物的设计及构效关系研究 中文摘要 抗生素的滥用导致的耐药菌出现并以惊人的速度增长已经成为威胁人类健 康的严重公共卫生问题。抗菌肽作为先天性免疫系统的重要组成部分，其非特 异性的膜破坏作用能够有效对抗包括多药耐药菌在内的多种病原菌引起的感染， 并且不容易诱导细菌产生耐药性，是一种具有极大发展潜力的新型抗菌剂。 Anoplin （GLLKRIKTLL-NH2 ）是从黄蜂毒液中分离得到的两亲性-螺旋 抗菌肽，具有广谱抗菌活性和极低的溶血活性，但是它的酶解稳定性差，抗菌 作用强度不够理想。 本研究为了改善Anoplin 的局限性，首先采用N- 甲基化氨基酸对Anoplin 中敏感酶切位点的氨基酸 （Leu ，Ile ，Lys 和 Arg ）进行替换，设计合成了 14 条含N- 甲基化氨基酸替换的Anoplin 类似物。酶解稳定性研究结果显示，N- 甲 基化氨基酸替换后类似物的稳定性得到显著改善，其中，与母肽Anoplin 相比， 6 5 类似物M4.7 抵抗胰蛋白酶和糜蛋白酶降解的能力提高了10 和10 倍，类似物 6 4 M5.7 耐受胰蛋白酶和糜蛋白酶降解的能力也分别提高了 10 和 10 倍，同时， 5 类似物M3.6 对这两种蛋白酶的稳定性均提高了10 倍。但是，抗菌活性研究同 时也显示，N- 甲基化氨基酸的引入对抗菌肽的抗菌活性造成了不利的影响，多 数类似物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性有不同程度的降低。对所 有N- 甲基化氨基酸替换类似物的二级结构研究显示，在细胞膜模拟环境中，母 肽Anoplin 和类似物M2 能够形成-螺旋结构，但其他的N- 甲基化氨基酸替换 类似物更倾向于形成-转角结构。 为了发展同时具有高抗菌活性和高稳定性的新型抗菌肽类似物，我们对上 述研究筛选出的3 条N- 甲基化氨基酸替换类似物M3.6，M4.7 和M5.7 进行了 进一步的N 端脂肪酸修饰改造研究，设计合成了12 条含N- 甲基化氨基酸及N 端脂肪酸修饰的新型Anoplin 类似物Cn-M3.6/M4.7/M5.7 （n=8,10,12,14 ）。抗菌 活性研究结果显示，N 端脂肪酸修饰显著改善了相应的N- 甲基化氨基酸替换类 I 似物的抗菌活性，并且，随着连接的脂肪酸碳链长度的增加，类似物抗菌活增 强，其中，类似物C12-M3.6/M4.7/M5.7 显示出最佳的抗菌活性。同时，这些类 似物在生理盐条件和血清环境中也显示出良好的抗菌活性。酶解稳定性研究结 果显示，所有的含 N- 甲基化氨基酸及N 端脂肪酸修饰的新型类似物均保留了 抵抗蛋白酶降解的高稳定性。安全性研究结果表明，随着连接的脂肪酸碳链长 度的增加，类似物溶血活性逐渐增强。圆二色谱研究发现，这些含N- 甲基化氨 基酸及 N 端脂肪酸修饰的新型类似物具有与 N- 甲基化氨基酸替换模板肽相似 的二级结构。 综合抗菌活性和溶血活性研究结果，我们选择类似物C12-M3.6/M4.7/M5.7 进行了更深入的活性和机制研究。联合用药结果表明，这3 条类似物与传统抗 生素利福平、万古霉素、卡那霉素和多粘菌素B 联合应用对抗金黄色葡萄球菌 和大肠杆菌时，表现出较显著的协同和增效的抗菌效果。同时，这些类似物还 能够有效抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜的形成。抗菌机制研究结 果显示，类似物C12-M3.6/M4.7/M5.7 能够通过破坏细菌细胞膜发挥快速杀菌作 用。此外，诱导耐药研究结果显示，与抗生素利福平相比，类似物 C12-M3.6/M4.7/M5.7 与大肠杆菌连续培养20 代后不容易诱导细菌产生耐药性。 综上所述，我们通过 N- 甲基化氨基酸替换以及N 端脂肪酸修饰，设计得 到了一类具有较高抗菌活性和抗酶解稳定性的新型抗菌肽类似物。本研究也为 今后抗菌肽的修饰改造提供了新的思路和方法。 关键词：抗