RNA反转录原理及应用 .ppt

* * * * * * * * * * * * * * RNA反转录原理及应用 原理 酶 过程 意义 本实验所用的技术 1 2 3 4 5 页码 RNA反转录 6 注意事项 RNA反转录原理 反转录是以RNA为模板,通过反转录酶(Reversetranscripatase),合成DNA的过程， 是DNA生物合成的一种特殊方式。 问题1：反转录酶是指代哪些？是特定的一个还是多个酶共同作用？ 答：反转录酶有两种，一种是来源于哺乳动物，另一种来源于鸟类。哺乳类的反转录酶都是一条多肽链；鸟类的反转录酶则由两上亚基结构。所以反转录酶是特定的一个酶，但是它具有多种活性，在反转录不同阶段中发挥不同的作用。 RNA反转录原理 [注]：反转录与逆转录不等同。反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外，逆转录在体内。 RNA反转录过程 反转录酶（RDDP)的活性 反转录酶 以RNA为模板，催化dNTP聚合成cDNA 反转录酶 RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子 RNase H活性 以反转录合成的第一条cDNA单链为模板，再合成第二条cDNA分子 DNA指导的DNA聚合酶活性 问题2：反转录酶能不能现在进行生物体外技术合成？ 答：反转录酶是生物中提取的。还不能自主合成。 反转录的生物学意义 （1）对分子生物学的中心法则进行了修正和补充 （2）在致癌病毒的研究中发现了癌基因，在人类一些癌细胞如膀胱癌、 小细胞肺癌等细胞中，也分离出与病毒癌基因相同的碱基序列，称为细胞癌基因或原癌基因。癌基因的发现为肿瘤发病机理的研究提供了很有前途的线索。 （3）在实际工作中有助于基因工程的实施。由于目的基因的转录产物易于制备，可将mRNA反向转录形成cDNA用以获得目的基因。 技术应用——RT-PCR RT-PCR又称反转录PCR。是将RNA的逆转录（RT）和聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的RNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得大量的cDNA。 问题3：cDNA与DNA的区别 答：cDNA就是由成熟mRNA经过反转录过程而成反转录的DNA,与正常DNA相比区别是内部无内含子等结构。 技术应用——RT-PCR 问题4：为什么选dT引物？ 答：真核生物的mRNA都有个PolyA的尾端，dT引物能识别这个尾端并且结合上去。 技术应用——RT-PCR 引物 ? 随机六聚体引物：对总RNA进行反转录 ?Oligo(dT)：对mRNA进行反转录 ? 操作——RT-PCR 以本实验下丘脑c-fos mRNA表达测定为列。 在微量EP管中加入以下反应溶液： 步骤1 dT 引物 dNTP 混合物 处理过RNA酶的水 操作——RT-PCR 以本实验下丘脑c-fos mRNA表达测定为列。 反应结束后在冰上急速冷却，并加入以下试剂： 步骤2 得到cDNA 引物 RNA 酶抑制剂 反转录酶 处理过RNA酶的水 * * * * * * * * * * * * * *