生物化学课件：09第十四章 DNA的生物合成1.ppt

DNA连接酶的功能 1、在复制中起最后接合缺口的作用； 2、在DNA修复、重组中起接合缺口作用； 3、基因工程的重要工具酶。 复制叉的结构及参与复制的酶与因子 * * * 大肠杆菌染色体DNA的复制 大肠杆菌染色体DNA的复制是从染色体的一个特定位置，即复制起始区（oriC）开始的双向复制，在环状染色体的相对位置上的终止区（terC）终止。整个复制过程可划分为3个阶段：复制的发动，复制叉的延伸和复制的终止。首先是切口酶在复制起点将一股超螺旋的DNA切开，在解旋酶的作用下DNA双螺旋解旋形成一个复制泡，此时切口被封闭，复制泡的两边各形成一个复制叉。一个顺时针移动，另一个逆时针移动，在复制叉处开始DNA的复制。在RNA聚合酶的作用下先形成一段与模板互补的引物RNA，然后在DNA聚合酶的作用下根据碱基配对原则将脱氧核糖核苷酸添加到引物RNA的3＇端，使DNA由5＇→3＇复制，从而使新链不断延长。由于在一个复制叉上亲代DNA的两条链皆是新DNA合成的模板，两条链又是反向平行的，而DNA的合成只能从5＇向3＇方向进行，所以在一个复制叉上随着复制叉的向前延伸，一条链的复制是连续的称为前导链，另一条链的复制则是不连续的称后随链。后随链合成的DNA中大部分是以小段形式存在的称为冈崎片段。每个冈崎片段都由一个RNA引物引发。当复制叉延伸到复制终点时，由DNA聚合酶I除去RNA引物并由DNA添补缺口，最后由DNA连接酶封闭切口，从而形成两个与原来完全一样的双链DNA环状分子。由于大肠杆菌染色体是环形的，所以两个复制叉汇合在起点对面距起点180°的终点。这样一个包括复制起点和终点的独立的复制单位叫复制子。大肠杆菌只有一个起点和一个终点，整个染色体为一个复制子。大肠杆菌染色体的复制速度很快，每分钟复制105核苷酸，完整染色体在40min内完成复制，从而为细胞的分裂做好了准备，保证了遗传物质的稳定性和连续性。 * * 核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。 单链的核酸外切酶包括大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ（exoⅠ）和核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）。核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）能够从5′-末端或3′-末端呈单链状态的DNA分子上降解DNA，产生出寡核苷酸短片段，而且是唯一不需要Mg2+离子的活性酶，是一种耐受性很强的核酸酶。核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）可以用来测定基因组DNA中一些特殊的间隔序列和编码序列的位置。它只切割末端有单链突出的DNA分子。 双链的核酸外切酶包括大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）、λ噬菌体核酸外切酶（λexo）以及T7噬菌体基因6核酸外切酶等。大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ）具有多种催化功能，可以降解双链DNA分子中的许多类型的磷酸二酯键。其中主要的催化活性是催化双链DNA按3′→5′的方向从3′-OH末端释放5′-单核苷酸。大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）通过其3′→5′外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA再配合使用Klenow酶，同时加进带放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。 * DNA聚合酶对碱基配对具有选择作用，它可以在合成前检验底物碱基与模板是否正确配对，即通过酶对不同碱基的不同构型表现不同亲和力来实现的。 DNA复制的精确度极高,在细菌中其误差率只有10-8～10-10，这意味着复制1000个细菌基因组才出现一个错误碱基，这使得物种遗传的保守性得到有力的保证。 * * 解螺旋酶(helicase) —利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链 引物酶(primase) —复制起始时催化生成RNA引物的酶 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整 * E.coli 人染色体基因组 4.4×106bp 3×109bp 1个复制起点和2个复制叉 多个复制起点和多个复制叉 单复制子 多复制子（104～105） 42分钟 8小时 1000bp/秒 100bp/秒 5? 3? 解链方向 3′ 5′ 前导链(leading strand) 后随链(lagging strand) 3? 5? 3