蛋白质及氨基酸 的测定.pptVIP

三、双缩脲法 1原理 在碱性条件下，铜离子和多肽(至少有两个肽键，如双缩脲、多肽和所有的蛋白质)生成的复合物呈紫红色，吸收波长为560nm，比色所得的吸光度值和样品中蛋白质的含量成正比。 2测定方法 (1)5mL双缩脲试剂和1mL蛋白质溶液(1~10mg蛋白质／mL)混匀。试剂包括硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠以及稳定在碱性溶液中的铜离子； (2)混合液在室温下放置15min或30min，然后在560nm处比色，读取吸光度值，并扣去空白； (3)如果反应液不澄清，在测定吸光度前可过滤或离心； (4)用牛血清白蛋白(BSA)建立蛋白质浓度与吸光度的标准曲线。 双缩脲法优点 ①该方法比凯氏定氮法费用低，速度快(可在不到30min的时间内完成)，是分析蛋白质最简单的方法； ②比福林酚法、紫外吸收法或比浊法更少发生颜色偏离； ③几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应； ④不需要测定非多肽或非蛋白质来源的氮。 缺点 ①不如福林酚法灵敏，分析时至少需要2~4mg蛋白质； ②如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加； ③高浓度的胺盐会干扰反应； ④不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同，如明胶的双缩脲反应产生红紫色； ⑤如果有高浓度的脂或碳水化合物存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色； ⑥此方法不是一个测量绝对值的方法，必须用已知浓度的蛋白质(如BSA)或经凯氏定氮法校正。 （四）乙酰丙酮比色法（GB/T 5009.5-2003第二法） §3氨基酸的测定 一、茚三酮比色法 1. 原理 氨基酸在碱性条件下与茚三酮作用生成蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，测定反应物的吸光度（λ570nm）可计算出样品中氨基酸含量。 2. 试剂 2%茚三酮 pH8.04磷酸缓冲溶液 氨基酸标准溶液 3.仪器 分光光度计 4. 测定方法 （1）样品处理 称样→加水、活性炭→加热提取→过滤→滤液定容 （2）标准曲线制备与样品测定 标准溶液(200μg/mL) 样液 标准或样液体积,ml 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 2.0 加入25mL比色管，加水至4.0ml 加1mL茚三酮 水浴加热15min 迅速冷却，定容至25mL，静置15min 测定吸光度（λ570nm) 0 A1 A2 A3 A4 A5 Ai 5. 结果计算 二、氨基酸自动分析仪法 1. 原理 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。 2. 试剂 3. 仪器 4. 测定方法 （1）样品处理 匀浆、称样 （2）水解 （3）测定 5. 结果计算 RckP9dD!Z8nbjm(#N7ToyY7)#m)yAQVq8OS+1DeLFIvP7iYB(VPrwFvM((mPVhOYmV*tZ(pRR3mdo4quC5pQC7U%XZoJ3(MC$5vl+!lE22%0Ld+nE387od)1NmgSj5C-RbFnSex-xG0qqJYLQQmb$fTffvDd1Q)rLvsn3HpIR4LG6y6jpMGtAdWOhU2MnNs9Ck3xf(n1NA%pcQnn4!759I#guY9-1*q+xwHH6Skoiq0BhBN52DwTbmZxVBlUZ(qtvVVV9ak%ZTnc-t8Qy)Ayd+fhbIl#-lymuMt-O*0dtU)Hr*DuBdSF)dIxq027Hvgo5VI%geAVSzisg6797NCmXeMFg+ikdJkNKtmPBaiCIlF33wWlDhw%*#5G##iUJ6BhYzYBk*hEfZyQeND9SL%5YKPe+JXi*516Xy-+mkRs%%3z5Cd4)KPzBoX4P5JVCa8pKExT%3KArZ(2SRTkc+4pP)vYNxpTMwPcTIRTjGrsFvV60wInBOnw)sr9g0sR9iSfw2YDEfClK8QbrFOr1sJV*%y+S7E0okeeN9H%9lQx14hhNkW)xe7WNcTwPAxD!FZRBNHP)fq9E2WXLOHFG(r%NvJceY!ORV9L6xSG%stgGT4fYDmbZhGtb-7dhFzmOcYn6(ndTFxw$V9d3(l426PCu#Fcrmc8#m*svO1ug#8+7sgG74d8K+e7#+ZN%ff4j(Y$bTD01fZ1PqAhK4IoHQoy3LK#I%5J*ThF+GHpY4AN%D9)tn5*Kp4p(hIOp21ljYG-M+giBH$dNPb%Jxr6OzE8f2t3ZwjCqGXrWQEFv