外源性DNA残留量测定法(药典)讲课稿.docx

外 源 性 DNA 残 留 量 测定法（药典） 附录区B外源性DNA残留量测定法 第一法DNA探针杂交法 供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可 与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链 DNA，称为杂交。将特异性单 链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链 DNA杂交，并使用与标 记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性 DNA对照比对后，可 测定供试品中外源性DNA的含量。 试剂（1）DNA标记和检测试剂盒 （2） DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。 （3） 2%蛋白酶K溶液 称取蛋白酶K 0.20g,溶于灭菌水10ml中，分装后 储藏于-20 C备用。 （4） 3%牛血清白蛋白溶液 称取牛血清白蛋白0. 30g，溶于灭菌水10ml 中。 （5） 1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8. 0） 用盐酸调pH值至 8. 0。 （6） 5. 0mol/L氯化钠溶液 （7） 0. 5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0） 用10mol/L氢氧化钠溶液 调节pH至8. 0。 （8） 20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液 用盐酸调pH至7.2。 （9） 蛋白酶缓冲液（pH8. 0） 量取 1mol/L Tris 溶液 1. 0ml （pH8.0）， 5mol/L氯化钠溶液2. 0ml，0. 5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8. 0） 2. 0ml， 20%SDS溶液2. 5 ml，加灭菌水至10ml。 （10） TE缓冲液（pH8. 0） 量取 1mol/L Tris 溶液（pH8.0） 10ml， 0. 5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8. 0） 2ml，加灭菌水至1000ml。 （11） 1%鱼精DNA溶液 精密称取鱼精DNA 0. 10g，置10ml量瓶中，用 TE缓冲液溶解并稀释至刻度， 摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小 分子，分装后贮藏于-20°C备用。 （12） DNA稀释液 取1%鱼精DNA溶液50 d，加TE缓冲液至10ml。 用于探针标记和阳性对照的 DNA制备 用于探针标记和阳性对照的 DNA，由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提 纯和鉴定可参考下述推荐方案进行，具体方法可参考《分子克隆实验指南》 （［美］J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社， 2002）或《精编分子 生物学实验指南》（［美］F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社， 1998）。 将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每 1ml含107个细胞，如果为 细菌，则将其浓度调整为每1ml含108个细胞细菌。取悬液1ml，离心，在沉淀 中加裂解液400 d混匀，37 C作用12?24小时后，加入饱和酚溶液450此 剧 烈混合，以每分钟10000转离心10分钟，转移上层液体，以饱和酚溶液 450 d 重复抽提一次；转移上层液体，加入三氯甲烷 450 d，剧烈混匀，以每分钟 10000转离心10分钟；转移上层液体，加入 pH 5.2的3mol/L醋酸钠溶液40 d l，充分混合，再加入-20r以下的无水乙醇1ml，充分混合，-20r以下作用2 小时，以每分钟15000转离心15分钟；用适量-20r 70%乙醇溶液洗涤沉淀1 次，以每分钟15000转离心15分钟，弃上清液，保留沉淀，吹至干燥后，加适 量灭菌TE缓冲液溶解，RNase酶切，酚/三氯甲烷抽提，分子筛纯化 DNA，即 得。 用1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的 DNA纯度：应无 RNA和寡核苷酸存在；A260/A280比值应在1.8?2. 0之间（测定时将供试品稀 释至A260为0. 2?1.0）。 用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声波处理，使 其片断大小适合于DNA杂交和探针标记。 阳性对照品的DNA浓度根据下式计算 DNA 浓度（ng/d） = 50XA260 阳性对照品可分装于适宜的小管中，-20 r以下保存，长期使用。 探针的标记 按试剂盒使用说明书进行。 测定法（1）蛋白酶K预处理 按下表对供试品、阳性和阴性对照进行加 样，混合后37r保温4小时以上，以保证酶切反应完全 加样量 2%蛋白酶 K溶液 蛋白酶缓冲 液 3 %牛血清 白蛋白溶液 加水至终体 积 供试品 100 d 1 d 1 d 200 d D1 100 d 1 d 1 d :适量 200 d D2 100 d 1 d 1 d 适量 200 d D3 100 d 1 d 1 d 适量 200 d 阴性 100 d 1 d 1 d 适量 200 d 注意事项：供试品的稀释 根据成品最大使用剂量，用 DNA稀释液将供试品（原液）稀释至每100d 含1人份剂量；如成品最大使用剂