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标准曲线常见问题分析 分析检测 中绘制标准曲线 目的 是可 以根 据标准 曲线 查出 待测 物质 的 含量，所 以标曲的制定是 实验 室工 作中 必不可 少的 工作 。在 真实 的 实验过程 中，制作标注曲 线会 遇到 各式 各样的 问题 ，比 如标 注曲 线 弯曲、线 性不够好等问题 ，造 成不 同情 况的原 因是 什么 呢？ 本文 将 详细介绍。 前期 测定 注意 事项 1、仪器校验好。 2、移取液体体积要精确，保证迅速准确，尽可能用一根移液管；为减小人为误 差，同一种液体要一个人操作。 3、保证标准品的纯度，所用标准品最好是新打开的，纯度较高的固体或溶液， 防止污染。 4、容器要保证洁净。 5、根据标准品理化性质注意加样的先后顺序。 6、如果要测 OD值，应保证测前各管液体充分混匀。 7、若还是有某个点误差较大，应舍弃。 8、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的，所以首先要把做标准曲线看 作是比做正式实验还要重要的一件事，否则后面的实验结果无从谈起。 9、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度，并且要能涵盖你 所要检测实验样品的浓度， 即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内， 包括上限 和下限。而对于呈 s 型的标准曲线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段， 即曲线几乎成直线的范围内。 10、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度， 这样就能够保证标准 样品的浓度不会出现较大的偏离。 11、检测标准样品时，应按浓度递增顺序进行，以减少高浓度对低浓度的影响， 提高准确性。 12、标准曲线的样品数一般为 7 个点，但至少要保证有 5 个点。 13、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动， 但一般来说， 相关系 数 r 至少要大于 0.98 ，对于有些实验，至少要 0.99 甚至是 0.999 。 分光光度法绘制标准曲线所遇问题 1、单 色光纯度不够 问题：标准曲 线上 端向下 弯曲 。 措 施 ：光度法中 要求 在最 大吸 收峰 处测 定吸光 度，光 度计 的有效谱带 宽度 越窄 越好 ，有 利于获 得纯 度高 的单 色光。 2. 比色皿的 厚度或光学 性能 不一致 如 果装 试剂空白 液的比色 皿较 其它 比色 皿薄 或对 光的吸收 和反射少 一些 ，则 曲线 的延 线与纵 坐标 相交 ；反 之，与 横坐 标相 交。 3. 显色反应 和反应条件 的问题 当显色反应的灵敏度不高时，被测物低于某一浓度就不能显色，当浓度不 同时，溶液对光的吸收、散射的程度不同，低浓度段往往弯曲，加上浓度 高时部分胶体颗粒的聚沉，致使测定的吸光度降低，曲线上端向下弯曲。 4. 操作上的原因 问题： 褪色反应，显色溶液的颜色不稳定、易褪色，若比色时间超过了稳 定时间，标准系列中高浓度溶液颜色减褪，致使曲线上端向下弯曲。 措施： 控制好显色剂的加入时间， 可以每加 3 份，停 3～3min ，再加上 3 份， 依次进行，以使每支比色管的显色时间相近。 5、干扰物质的影响 标准曲线检验 标准 曲线 的检 验是 实际操 作中 最大 的难 点 ，也是 工作 中误 区和 争议最 多的 话题 了！ 先来 了解 下最 重要 的三大 检验 项目 ： 1. 精密度检 验 标准曲线的精密度检验：精密度检验就是看试验点距离拟合的直线的距离 有无异常，所以也称线性检验（拟合检验），需用 F 检验， P0.05 作为线 性检验合格的标准。 2. 截距检验斜率检验 标准曲线的截距检验和斜率检验分别考察 Y=a+bX中 a 和 b 与 0 的统计学差 异，a 与 0 有差别说明有试剂空白或系统误差，而 b 若与 0 没差别说明仪器 的灵敏度根本达不到分析要求。 标准曲线的检验应该是线性检验结合失拟检验，以及残差的正态 性检 验结合才是 统计学 上比较完 备的。 接下来，我们看看实验员在标准曲线使用中还遇到过哪些问题？ 问题一 ：标准曲线需要人为的 增加（0,0 ） 点吗？ 答：不能。通常的标准系列多是配制 0,1,2,3mg/L 系列这样的说法， 没做实验人 为添加（ 0,0 ）很不妥，因为很多时候 0 管进入仪器可能也有响应值，这也是我 们考察试剂空白的一个重要步骤。 这个 0 管在某些时候非常重要， 如，全血铅测 定，我们采用牛血清来基体匹配标准系列， 如果此时你用酸做空白或没做实验人 为添加（ 0,0 ），那你就很难做好标准曲线，所以，标准曲线的 0 管也是做好标 准曲线的重要考虑点。 问题二 ：标准曲线需要减掉试 剂空白 来做吗 ？ 答：不需要。仪器测出来标准系列的响应值可以减掉试剂空白或减掉 0 管的响应 值来做， 工作中我们也常用 0 管来做仪器调零。 其实没有必要那么麻烦， 即使空 白或 0 管有响应值， 在构建标准曲线时， 我们