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CRISPR/Cas9 系统在斑马鱼基因编辑研究中的应用 随着斑马鱼(Danio rerio)基因组测序工作的完成,研究人员发现斑马鱼与 人类(Homo sapiens)基因同源性较高,针对这一特点,研究人员构建了多种人类 疾病的斑马鱼模型,用于探究疾病发生机制。基因编辑技术的应用促进了斑马鱼 基因功能研究的发展,先进的基因编辑技术CRISPR/Cas9 系统,因其简单高效正 广泛被应用。 本研究利用CRISPR/Cas9 系统敲除斑马鱼lncRNA 基因启动子区以及将 dCas9 基因敲入斑马鱼基因组。本文主要的研究内容如下：1、为了研究 Nondret002679 在斑马鱼胚胎各时期以及成年后各组织中的表达规律,首先收集 0 hpf(合子期)、3 hpf(囊胚期)、6 hpf(原肠期)、12hpf(体节期/5-体节)、 24hpf(咽囊期)及48hpf(孵化期)的斑马鱼胚胎提取总RNA,逆转录为cDNA,采用 荧光定量PCR (RT-qPCR)方法检测Nondmt002679 的表达规律。 同时收集成年斑马鱼的心脏、肝脏、睾丸、卵巢、肌肉、尾鳍7 组织样,同 样采用RT-qPCR 方法检测Nondret002679 的表达规律。结果显示,24 h 时 Nondret002679 表达量是O h 的457 倍(plt;0.01),48 h时是O h 的1066 倍 (plt;0.01),前4 时期Nondret002679 的表达无差异(pgt;0.05)。 Nondret002679 在大脑中高表达,是心脏的248 倍,(plt;0.01),其他组织与 心脏相比表达量增加,但差异不显著(pgt;0.05),因此表现出组织特异性。这些 结果为进一步研究Nondret002679 的生物学功能提供依据。 2、利用CRISPR/Cas9 系统敲除Nondret002679 基因的预测启动子区以沉默 其表达。首先根据预测启动子区上下游序列设计靶向不同位点的向导RNA(guide RNA) gR1、 gR2、 gR3、 gR4、 gR5 和：gR6 gRNA。 将gRNAs 与Cas9 mRNA 一起显微注射到斑马鱼卵中。PCR 鉴定28 尾2 月龄 斑马鱼发现,11 尾发生敲除,敲除率为39%。 将启动子区敲除的F0 杂合斑马鱼繁殖,获得33 尾F1 代,经鉴定有6 尾F1 斑马鱼启动子区缺失,其中3 尾为启动子区纯合缺失。选启动子区敲除的F0 杂合 斑马鱼5 尾,利用RT-qPCR 方法分析Nondret002679 转录情况,有4 尾斑马鱼 Nondret002679 转录水平下调,这表明启动子区敲除对基因转录有影响。 3、利用CRISPR/Cas9 系统进行基因敲入,建立dCas9 定点敲入斑马鱼基因组 模型。首先设计dCas9 donor载体,根据dCas9 donor 同源臂长度不同分522 donor 和1092 donor 两组。 522 donor 组成功敲入效率为25.6%,纯合敲入斑马鱼占该组敲入斑马鱼的比 例为40%；1092 donor 组敲入效率为20.5%,纯合敲入斑马鱼占该组敲入斑马鱼 的11%。最后用RT-PCR 方法分析dCas9 的表达情况,结果显示其可在斑马鱼体内 表达,成功构建了dCas9 斑马鱼模型,该研究建立的模型可为研究基因功能提供 重要的工具。 综上所述,CRISPR/Cas9 系统可高效敲除lncRNA;基因的启动子 ,同时启动 子区敲除的杂合斑马鱼lncRNA 基因转录水平明显下调,为研究lncRNA 功能提供 了有效的基因编辑工具。dCas9 斑马鱼模型可用于激活或抑制感兴趣基因的表达, 为研究基因功能提供了有用的工具。