CHO细胞培养过程中单克隆抗体碱性电荷变体的表征与优化.pdfVIP

CHO 细胞培养过程中单克隆抗体碱性电荷变体的表征与优化 电荷异质性是抗体的一个关键质量属性,在抗体药物的研发和生产过程中被 极大重视。虽然许多引发电荷变体的体外化学机制较为清楚,但在细胞培养过程 中由于涉及多重因素,特别是各种培养基组分以及它们之间的相互作用,造成电 荷变体形成的根本原因尚不清楚,因此,迫切地需要更多的研究来深入阐释抗体 电荷变体的形成原因及相关机制。前期在CHO(Chinese hamster overy,CHO)细 胞无血清培养基开发过程中发现,添加尿苷可大幅提高最大活细胞密度以及抗体 的表达量。 本研究在验证此结果的基础上,首先分析了尿苷的添加对抗体电荷变体、糖 基化、聚体、片段化、疏水性等质量属性的影响,研究发现尿苷的加入并未改善 抗体碱性电荷变体含量极高的问题。为此,进一步考察了流加培养基中添加尿苷 后生产的抗体中碱性电荷变体的组成,结果发现在碱性电荷变体组成中虽然赖氨 酸变体含量大幅减少,但抗体Fab(Fragment of antigen binding,Fab)区甲硫氨 酸和色氨酸的氧化比例增多。通过过氧化氢和AAPH(2,2’ -Azobis(2-methyl-propionamidine)dihydrochloride,AAPH)孵育实验证实,甲 硫氨酸氧化和色氨酸氧化均是mAbl 抗体碱性电荷变体形成的重要因素。 随后,通过在细胞培养基中添加牛磺酸、柠檬酸铁铵、N-乙酰-L-半胱氨酸、 水飞蓟素和硫辛酸等抗氧化剂希望降低碱性电荷变体的含量,发现牛磺酸不仅使 抗体碱性电荷变体的含量降低,并提高主峰的含量,而且还使最大活细胞密度略 有提高,抗体产量显著增加,同时添加牛磺酸对抗体的糖基化、聚体以及片段化等 质量属性影响较小。进一步研究表明,牛磺酸使抗体碱性电荷变体减少的关键在 于抗体的赖氨酸变体和氧化变体的减少,实时荧光定量PCR 和无细胞孵育实验显 示,牛磺酸可能通过促进碱性羧肽酶的表达使赖氨酸变体减少。胞内活性氧水平 和培养液氧化还原电位的检测结果显示,牛磺酸可能是通过抑制活性氧的形成以 及提高培养液的还原性来减少氧化变体的生成。 本研究结果为将来调控生产过程中抗体电荷异质性的产生、提高抗体药物的 产量和质量提供指导。