实验一植物DNA的提取与纯化.docx

百度文库- 百度文库-让每个人平等地提升自我 PAGE PAGE # 实验一 植物DNA的提取与纯化 一、 实验目的： 掌握植物DNA的提取与纯化的原理和一般步骤。 二、 实验原理： 植物DNA的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求。对 DNA提取一般有三个要求：1. DNA的纯度可以满足下游操作的要求； 2. DNA必须完整; DNA应当有足够的量。 一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带 合适末端的有效片段很少。而进行 RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度 以上，可保证酶切后产生 RFLP片段（20kb以下），并可保证包含 PCR所扩增的片段（— 般2kb以下）。 天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。要从细胞中提取 DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质和糖去除，同时除去 RNA及无机离子等，从 中分离DNA。 提取植物DNA的方法主要采用 SDS和CTAB法，对它们进行稍加修改就可以应用于 DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护 DNA不受内源核酸内切酶降 解。本实验采用SDS法提取DNA°SDS是有效的阴离子去垢剂，细胞中DNA与蛋白质之 间常借静电引力或配位键结合 ，SDS能够破坏这种价键。具体方法简单说来就是利用液 氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的 SDS溶解膜蛋白而破坏细 胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。 EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法 去除蛋白，得到的 DNA溶液经乙醇沉淀。 三、 实验材料和试剂： 1?实验材料：新鲜植物组织（小麦嫩叶） 。 2?器材：研钵和研棒、水浴锅、离心机、移液器及枪头、离心管。 3?药品试剂：提取液、无水乙醇、 70%乙醇、TE缓冲液、氯仿戊醇（24:1 ）。 四、 实验步骤： 1?取新鲜叶片约3g,剪碎,加入液氮充分研磨后转移至 2ml离心管中； 在 65C预热的提取液中按 L加入Na Bisufite , 充分混匀； 3?在管中加入适量提取液， 60 C水浴保温约30min，不时颠倒混匀； 4?冷却至室温后加入等体积氯仿 /异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动 15min左右； 5?室温下10000rpm离心15min ,小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体积的冷酒精， -20 C放置 1h； 6?挑出DNA置于新的管中。加入适量 70%酒精，摇动洗涤10min，重复洗涤2-3次； 7?吹干DNA,加入适量TE在65C溶解，4C或-20C贮存。 五、 实验结果： 如下图所示，所提 DNA的琼脂糖凝胶电泳结果如示： 百度文库- 百度文库-让每个人平等地提升自我 PAGE PAGE # 其中第八泳道（从右至左，箭头所指）为我们所提 DNA的电泳结果。可以看出有两条 比较亮的带，其中靠近点样孔的条带为 DNA带，远离点样孔的条带为 RNA带。由于此次实 验没有对RNA消化，所以泳道有 RNA条带。 六、注意事项： 尽量取材幼嫩组织，最好在早晨取材，可以避免过多的糖分污染； 2?提取液不能加入过多，否则影响后续反应的进行； 3?加入提取液后应多次颠倒混匀，以确保反应充分进行，颠倒不能过于剧烈，剧烈颠倒 会导致DNA分子的断裂； 4?加入氯仿：戊醇后要剧烈摇晃，确保杂质去除彻底； 5?微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中。 百度文库- 百度文库-让每个人平等地提升自我 PAGE PAGE # 实验二PCR和分子标记技术及其应用 一、 实验目的： 掌握PCR的基本操作及分子标记技术的应用。 二、 实验原理： PCR原理：类似于DNA的体内复制。首先待扩增 DNA?模板加热变性解链，随之将 反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高 使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以延伸。？这种热变性-复性-延伸的过程就是一个 PCR 循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。分子标记具有数量 丰富、信息量大、与生长发育无关，取材不受限制；较多共显性，信息量完整在真核生 物中，基因组DNA多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大 量的不编码的 DNA序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约。可以用于种质 资源研究、品质纯度鉴定、构建遗传连锁图、基因定位（ QTL）、标记辅助选择、比较 基因组研究、基因克隆（图位克隆）、生物起源进化的研究。 （1） RFLP物种的基因组 DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的 片段，用放射性同位素标记的 DNA作探针，把与