双链dna复制的分子机制.pptxVIP

4、双链DNA复制的分子机制 （以大肠杆菌为例） 双链的解开 RNA引物的合成 DNA链的延伸 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段;(1)双链的解开;复制原点由DnaA蛋白识别， 在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶Π 、 SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。 DNA复制进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长点(growth point)，叫复制叉。在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为复制体（replisome） ;; （2）RNA引物的合成;（3）DNA链的延伸;在DNA聚合酶Ⅲ的作用下，在引物的3’-端逐个添加与模板碱基顺序互补的脱氧核苷酸单位以完成冈崎片段或完整链的合成。然后通过DNA聚合酶Ⅰ的5’至3’的外切酶活性将RNA引物上的核苷酸单位逐个除去。每个核苷酸单位被切除后立即被与模板链相应位置碱基互补的脱氧核苷酸补上。这后一反应是利用前面的冈崎片段作为引物通过DNA聚合酶Ⅰ的聚合酶活性完成的。 ;领头链—在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。 随后链—在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链。 半不连续复制—在DNA复制时，领头链是连续合成的,而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。 发现（1968）： 同位素实验，3HdT? 短时间内为DNA小片段?一段时间后?检测到 DNA大片段。当用DNA连接酶的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。——证明DNA复制中有小片段合成。 测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。由于U替代dT，被尿嘧啶-N-糖基酶切除。 在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。 ;冈崎片段 在DNA复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只能是断续的合成5??3 ?的多个短片段，这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。 冈崎片段：真核生物中100-200个核苷酸（核小体的DNA单位）。原核生物中1000-2000个核苷酸（相当于一个顺反子）。 ; 1968年冈崎等用3H脱氧胸苷掺入噬菌体感染的大肠杆菌，然后分离标记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短是DNA片段，接着出现较大的分子。一般把这些DNA片段称为冈崎片段。进一步研究证明，冈崎片段在细菌和真核生物中普遍存在。细菌的冈崎片段较长，约有1000-2000个核苷酸；真核生物的较短，约为100-200个核苷酸。 冈崎等最初做的实验不能判断DNA链的不连续合成只发生在一条链上，还是两条链都如此。后来进行了大量的实验证明，在DNA进行复制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的。也就是说，聚合酶沿复制叉移动时，模板链为3’至5‘的一条链是连续合成的，而模板链为5’至3‘的一条链是不连续的。人们就将这种复制方式称为半不连续复制。 由于DNA复制酶系不易从DNA模板上解离下来，因此前导链的合成总是连续的。但由于很多因素可影响到前导链的连续性，例如模板链的损伤、复制因子和底物的供应不足等，都会引起前导链复制中断并从另一新点起始。;（4）切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段 （复制终止）; 连接是DNA 连接酶的作用：各冈崎片段通过DNA连接酶相互连接最终形成后随链。DNA 连接酶催化一个DNA链的5’-磷酸根与另一个DNA链的3’-羟基形成磷酸二酯键，但是这两个链必须都与同一个互补链结合，而且两个链必须是相临的，反应需要能量。 ; DNA复制体的结构：DNA 合成的生点，即复制叉上，分布着各种各样于复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA链上形成离散的复合体，彼此配合，进行高度精确的复制，这异结构称为复制体（replisome)。这种复制体于细胞内存在的一般游离体（例如核糖体)不同，复制体只是于复制叉DNA特殊结构相结合的蛋白质复合物。就现在所知，涉及DNA复制过程的酶和蛋白质因子共有30多种。右图为复制体的最主要成分和复制的过程示意图解。 图中DNA复制叉上进行的基本过程包括：双链的解开；RNA引物的合成；DNA俩的延长；切除RNA引物，添补缺口，连接相临的DNA片段；切除和修复掺入DNA链的脱氧尿苷酸和错配碱基。 ;5、真核DNA 的复制：真核细胞DNA结构相当复杂，有关DNA复制的研究主要来自原核生物。但近年来，由于一些新技术的应用和体外复制系统的建立，真核细胞DNA的复制研究也有了较大进展。在真核细胞中也发现了冈崎片段、R