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第二章 基因工程制药;2.4 基因工程菌生长代谢的特点;2g/L 4g/L; μ为比生长速率(h-1) ，表示单位浓度细胞的生长速率。 二、 乙酸的产生 大肠杆菌在较高的比生长速率下会产生乙酸，高浓度的乙酸会抑制菌体生长和蛋白表达。 控制菌体生长可控制乙酸产生。 ;2.5 基因工程菌的稳定性; 二、 提高质粒稳定性的方法 1. 选择合适的宿主菌株 2. 选择合适的载体 低拷贝数质粒丢失的频率较大 含高拷贝数质粒的菌比生长速度明显低于不含质粒菌。 3. 加入抗生素; 二、 提高质粒稳定性的方法 4. 分阶段培养 表达水平越高，重组质粒越不稳定。 二阶段培养： 第一阶段 菌体生长 第二阶段 诱导表达 5. 控制培养条件 高比生长速率下质粒稳定性明显增加。 培养基成分、温度等培养条件对质粒稳定性也有影响。 6. 固定化 固定化适用于分泌表达的蛋白，对非分泌表达蛋白难以大规模采用。;2.6 基因工程菌的发酵; 3、 连续培养（continuous culture） 培养开始时为分批培养，培养至一定程度后，连续不断的补加新鲜培养基同时排出等量培养液。 一定时间后，细胞浓度和培养基中各种物质浓度均保持不变。 基因工程菌不稳定，很难连续培养。 4、透析培养（dialysis culture） 通过透析除去乙酸。 E.coli HB101(pPAKS2)生产青霉素酰化酶提高11倍。; 5、 固定化培养（immobilized culture） 质粒稳定，便于连续，适用于分泌表达。 ;二、 基因工程菌的培养工艺; 3、温度的影响 温度对基因表达的调控机理很复杂，对不同蛋白，最佳的诱导表达温度不同。 4、溶氧（dissolved oxygen，DO ）的影响 较高水平的DO（大于10~30％）的有利于蛋白表达，供氧不足，产生乙酸。 加大搅拌、增加气流、提高氧分压、提高罐压。 控制糖源的流加速度。 恒溶氧发酵：通过以上手段控制DO在一恒定值。 ; 5、pH的影响 流加酸、碱调节pH。 pH一般控制在6.8~7.6，少数例外。 6、诱导时机的影响 一般在对数生长期进行诱导表达。 ;分批发酵不同生长阶段加1mM IPTG诱导 表达后的生长曲线 正三角（对数早期） 倒三角（对数中期） 菱形（对数晚期） 圆形（不加诱导）;三、高密度发酵;三、高密度发酵;三、高密度发酵;2.7 基因工程药物的分离纯化;2.7 基因工程药物的分离纯化;三、 细胞破碎 物理方法 珠磨、高压匀浆、超声波破碎、匀浆、冻融、低渗裂解、研磨等 化学方法 有机溶剂（甲苯、丙酮等）、表面活性剂等。 生物方法 酶法：溶菌酶、葡聚糖酶、溶壁酶等； 自溶：一定pH和温度；一般采用加热法，自溶时间较长。 ; ; ;四、 固液分离 胞外蛋白：离心 包含体：离心、低速离心 胞内蛋白：去除细胞碎片 高速离心、微滤（0.1～10um）、 双水相萃取（PEG-Dextran、 PEG-盐系统）、絮凝、膨胀床吸附 ; 五、分离纯化方法 主要为各种层析方法： 离子交换层析、凝胶过滤、疏水层析、亲和层析 超滤 六、非蛋白类杂质的去除 DNA（离子交换、疏水层析等） 热原（脂多糖，超滤、阴离子交换、疏水层析、多黏菌素B亲和层析） 病毒（紫外线照射、40nm膜过滤）; 七、选择分离纯化方法的依据 根据产物表达形式来选择 分泌表达（超滤、沉淀） 胞内可溶表达（亲和层析、离子交换） 周质腔表达（溶菌酶处理后渗透压休克） 包含体（离心回收） ; 七、选择分离纯化方法的依据 根据分离单元之间的衔接选择 初步纯化（超滤、沉淀；浓缩、去主要杂质）－－ 高分辩率纯化（亲和层析、离子交换等色谱方式） 色谱之间的分离次序： 盐析沉淀、离子交换后可直接采用疏水色谱 亲和层析通常放在第二步纯化之后