鸡胚成纤维细胞的原代培养.pdfVIP

鸡胚成纤维细胞的原代培养 171850044 生拔钱诗晨 一、背景知识 1.1 原代培养与传代培养 1.1.1 原代培养 是指直接从生物体取材 （细胞、组织或器官）进行的第一次培养 （中途不分 割培养物、不更换培养物的生长器皿）。 1.1.2 传代细胞培养 分割细胞培养物进行的再配养 注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数 1.2 细胞体外培养要求的条件  无菌  适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右   生理渗透压  适宜酸碱度：7.2-7.4  气体：95%空气+5%二氧化碳  培养基：提供水、各种有机营养 （糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等 1.3 培养细胞生长类型  悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。而呈现悬浮生长的细胞。  贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。又称黏附依赖型 细胞 （分如下四类）  成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射 状。  上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。  游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规 则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。在一定条件下，如培养基化学性质 变动等，它们也可能成纤维细胞形态。  多形型：是一些形态上不规则的细胞。细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多 边形，胞突呈细长丝状。如神经元和神经胶质细胞 1.4 原代细胞培养的一般办法 1.4.1 植块培养法 直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养 的方法 1.4.2 离散细胞培养法 用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行 培养的方法 注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植 物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下 进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 二、实验目的  了解体外培养的原理及原代细胞培养的基本方法  掌握无菌操作的一般技术  学习观察体外培养细胞的形态及生长状况 三、实验原理 模仿体内生长环境，使来自机体的细胞、组织、器官能够在人工培养条件下生存、生长、繁 殖。 四、实验材料、试剂及用品 4.1 实验材料：7-12 日龄鸡胚 注：幼体组织 （尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养；分化程度低的组织比分化高 的容易培养；肿瘤组织比正常组织容易培养。 4.2 实验试剂  Hanks 液  D-Hanks 液  0.25%胰蛋白酶  M199 基础培养液  小牛血清  青、链霉素  5%NaH CO 3  2%碘酒  75%酒精  重铬酸钾洗液 4.3 培养用主要仪器设备及用品  纯水设备  干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器 （真空式、针头式）及0.22 μm 滤膜  超净工作台  培养设施：普通培养箱、CO2 培养箱  贮存设备：冰箱、液氮罐  观察设备：倒置相差显微镜  其他设备：天平、离心机、水浴锅等  用品：培养瓶皿、计数板、解剖器械等 五、实验操作 5.1 培养前的准备工作 5.1.1 用品清洗 玻璃用品：用重铬酸钾洗液浸泡24h 以上，再用自来水、去离子水冲洗 金属、乳胶、塑料用品：不可用重铬酸钾洗液浸泡 5.1.2 用品包装及消毒 玻璃、金属用品：牛皮纸包裹或封口，干热180℃ 2h 乳胶、塑料用品：纸包裹或置于封闭容器 （如不锈钢饭盒），高压蒸汽 （湿热）121℃维持 15~20min 5.1.3 溶液配制与消毒 无生物活性、不易挥发或分解的溶液 （如平衡盐）：高压蒸汽灭菌 有生物活性的溶液 （如培养液、肝素钠、PHA、酶等）及易挥发的溶液 （如碳酸氢钠等