纤维素分解菌的分离和鉴定教学提纲.docxVIP

纤维素分解菌的分离和鉴定 纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验 一、实验背景 纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球上数量最大的可 再生资源。如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短 缺、解决环境污染，又能形成新的产业。由于在自然界中存在着大量产纤维素 酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。从 20世纪 40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并 逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选 的研究报导已有很多，如细菌中的生抱噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌 属等；放线菌由于能形成芽抱，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温 阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。主要有诺卡氏菌属、链霉 菌属、芽抱杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲 霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。以羧甲基纤维素钠和添加少量 葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和 稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定 纤维素酶产生菌酶活大小。与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长 快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关 系。纤维素是世界上所有植物的组成部分，是地球上最为丰富且可再生的资 源。随着世界能源形势趋于恶化，环境问题日益加剧，利用纤维素生产有高附 加值资源的以维持人类可持续发展的研究方向近年来逐步成为科学研究的热点 方向。利用微生物将纤维素、半纤维素降解转化为生物产品或生物能源即可缓 解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。因此分离和筛选高酶活性的 菌株是有效利用纤维素物质的关键。 二、 实验目的 从目标试样中分离筛选出具有降解纤维素能力的菌株。 三、 实验材料： 1、 样品的采集 1） 风干土样 E4-1、E2-6、E2-6 试样。 2） 潮湿土样 E4-1、E2-6、E2-6 试样。 3） 牛粪样品2份 以上实验材料全部取自三教微生物实验室冰箱中； 2、 培养基 1） CMC培养基 2） LB培养基 3） 高氏1号培养基 4） PDA培养基 3、 其他物品 天平，称量纸，药匙，试管架，涂布器、摇床、烘箱、灭菌锅、瓶子、 45ml无 菌水（带玻璃珠），含9ml无菌水的试管，无菌培养皿，1ml及0.08ml移液 管。 四、 实验步骤： （牛粪中纤维素降解菌类的分离与鉴定） 1、 牛粪取样 于冰箱取2个牛粪样品各5g。 2、 选择培养 实验准备：将实验所需平板约 60个，两个锥形瓶(各45ml无菌水加少量 玻珠)，14支9ml无菌水灭菌。 培养基的配置：参照配方配制培养基①羧甲基纤维素钠培养基② LB培养 基③咼氏一号培养基。在121 C下咼压火菌20min。 将2份牛粪样品于超净工作台内放入 45ml锥形瓶内，即为10-1悬液，于 1500r/min 摇床 15min。 用移液枪吸取10-1悬液1ml打入9ml无菌水中，即为10-2悬液，如此重 复，依次制成10-3至10-8悬液。 倒平板：将灭菌后的各个培养基在无菌操作下倒 20ml左右于培养基中， 凝固后待用。 涂布平板：将稀释度为10-6至10-8悬液各取0.08ml涂布到平板培养基 上，每个梯度需涂布2个平板，设为对照。置于培养箱中培养观察，持续观 察，直到出现明显的菌落。 3、 挑菌保种 将出来的明显菌类按照类别分别保种到不同的斜面培养基中。 4、 刚果红鉴定 配制刚果红培养基，将菌株点样与刚果红培养基上，置于培养箱培养。观察各 个菌株是否具有分解纤维素的能力。 (从湿土中提取纤维素菌) 1、 分别配制①羧甲基纤维素钠培养基② LB培 养基③咼氏一号培养基 ④PDA培 养基各500ml，装进5个瓶子中。在14根试管中分别加入9ml蒸馏水，并用试 管塞塞紧。在两个锥形瓶中分别加入 45ml蒸馏水，并且放如玻璃球，用封口膜 封好。包90个平板。准备1ml和0.1ml移液枪的枪头。将以上5种物品用报纸 包好后放入灭菌锅中121T灭菌30分钟。同时将操作台的紫外线打开。 2、 待灭菌完后，将物品取出，放入烘箱烘干。 3、 将烘干后的平板、试管、锥形瓶、枪头放入操作台里。两种湿土样分别称取 5g,在操作台里加到锥形瓶中，封口，放到摇床上摇 30分钟。 4、 摇好后取回，关闭操作台的紫外线。取 7支试管并分别标号-2、-3、-4、- 5、 -6、-7,用1ml移液枪从一个锥形瓶中吸取1ml菌液，射到-2号试管中，换 枪头，从-2号试管中吸取1ml菌液射到-3号试管中，以此类推。另一个锥形瓶 的菌液也要经过同样的操作。 5、取一个培 养基 （例如LB培 养基）， 倒2