【课件-组织化学】_免疫化学.pptVIP

（3）抗原纯度鉴定 取决于方法灵敏度与分辩率 PAGE 等电点聚焦电泳 只显示固有条带时，认为是电泳纯 免疫电泳 免疫纯 抗原合成方法 人工合成多肽（全成肽） 根据基因序列翻译为多肽序列并进行人工合成以制备抗体 优点：（1）未知功能基因研究： 迅速制备抗体 （2）可选择特异性大的片段制备高效价的抗体 （3）蛋白结构域的研究 缺点： （1）半抗原: 必须先连接到大分子载体上才能使用， 常用方法：戊二醛法 MBS法 (2) 必须选择蛋白表面多肽序列 a.几段多肽，b. 亲水的羧基或氨基端 c.非两端多肽，选用亲水高肽 (3) 长度受限: 10-20氨基酸序列 细菌超表达克隆化基因作为抗原的常用方法及原则 （1）基因CDNA 插入细菌扩增质粒中备用 （2）原核生物表 达法 真核生物 表= 达法 病毒转染细胞表达法 昆虫细胞表 达法 （3）主要原则 a.尽可能的全长蛋白质 b.小样表 达 c.包涵体型 附：基因工程方法制备抗原 Telomeres(端粒）染色体末端DNA重复序列串联 人的重复序列串联为TTAGGG hTRT(human Telomeric Reverse Transcriptase)在肿瘤中活性很高 技术路线： K562（人髓性白血病细胞）→总RNA→RT-PCR→1.2Kb DNA片段→ 克隆至pGEM-T Easy vector→扩增、测序→ 亚克隆至PinPointXa-1 vector →大肠杆菌表达 →亲和层析纯化→融合蛋白（含目的多肽）→单抗 2. 抗体制备 单克隆、多克隆抗体 抗原决定簇（antigenic determinant) 抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团 又称表位( epitope) 单克隆抗体 只针对某一特定的抗原决定簇，常采 用杂交瘤技术制备 多克隆抗体 针对多个抗原决定簇的抗体，实际上 是多个单克隆抗体的混合物 Mc Ab Mc Ab Mc Ab Pc Ab 多克隆与单克隆抗体的比较 多克隆抗体 单克隆抗体 分子结构 不均一 均一 与抗原决定簇反应 多价 单价 特异性 取决于抗体 强 亲合力 有强有弱 取决于抗体 免疫组化染色 较强 取决于抗体但背景清 琼脂双扩散 可见沉淀线 取决于抗体 ELISA 取决于抗体 结果较好 免疫印迹 结果好 取决于抗体 *将多株单克隆抗体混合使用效果更胜一筹 （1）多克隆抗体制备 a.动物 提供抗原的动物种系与产生抗体的动物种系相差越远越好 选取何种动物取决于：饲养条件 抗原量: 所需抗血清量 常用动物： 小鼠、兔（新西兰家兔）、羊、马、猪等 b. 佐剂 (Adjuvant) 增强免疫，提高抗体效价 常用福氏佐剂（85%石蜡油+15%羊毛脂） 加卡介苗（2mg/ml佐剂）则为完全福氏佐剂(FCA) 首次用 1/2体积FCA+1/2体积抗原溶液 二次或三次加强时 用不完全福氏佐剂或不用佐剂 乳化： 水面上长期保持圆珠形而不散开 c.半抗