重组克隆的筛选方法.docVIP

重组克隆的筛选方法 重组克隆的筛选方法：1、抗性筛选；2、蓝白斑筛选；3、酶切电泳筛选；4、PCR筛选； 5、测序验证； 6、表达筛选；7、生物活性筛选 1、抗性筛选—质粒载体携带的筛选标记（AmpR 氨苄青霉素抗性；TetR 四环素抗性；KanR 卡那霉素抗性） 特点：一般用抗性培养基做初级筛选，只能保证有载体转入，不能保证外源基因插入 2、蓝白斑筛选--β-半乳糖苷酶 (lacZ)的显色反应 α-互补：lacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的lacZ可分解培养基平板中的底物X-Gal，生成蓝色物质。（需要IPTG的诱导表达） 外源基因插入载体后，使载体部分lacZ失活，无法进行α-互补—白斑。 　 特点：未载入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选；无法确定基因插入的方向；特殊—基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分lacZ失活，将产生α-互补，产生蓝斑 蓝白斑筛选的原理 分类:生物科学蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有 β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个 多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨