水产微生物 实训十九 水中细菌总数的测定 技能实训 平板菌落计数法.docxVIP

技能实训 微生物数量的测定 一、技能目标 1. 熟悉血球计数板的构造与原理，掌握利用血球计数板进行微生物直接计数的方法。 2. 掌握平板菌落计数法的原理，熟练应用平板菌落计数法测定样品中的微生物数量。 二、实训器材 1. 菌种 酿酒酵母斜面培养物、大肠杆菌菌悬液。 2. 培养基 平板计数琼脂培养基。 3. 仪器及用品 普通光学显微镜、恒温培养箱、水浴锅、血球计数板、计数器、无菌培养皿、无菌滴管、10mL无菌刻度吸管、1mL无菌刻度吸管、无菌生理盐水、吸耳球或助吸器、试管架、酒精灯等。 三、技能操作 任务二 平板菌落计数 1. 知识要点 平板菌落计数法是测定样品中活菌量的常用方法。将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到培养基中，经过培养每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落相当于原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的活菌量。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3个或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)/ mL，而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 2. 操作步骤 以检测贝类软体部微生物为例。 （1）样品前处理：采取贝类，先用流水洗刷贝壳，洗净后放在铺有灭菌毛巾的清洁搪瓷盘或工作台上，操作者将双手洗净并用75%酒精棉球涂擦消毒后，用灭菌小刀从贝壳张口缝隙处切入，撬开贝壳，再用灭菌镊子取出软体部，称取25g置于灭菌研钵中，用灭菌剪刀剪碎，放置适当数量的灭菌玻璃球研磨（有条件可用灭菌均质器中，以8000～10000rpm的速度处理1min），检样磨碎后加入225mL灭菌生理盐水，混匀制成10-1的稀释液。 图3-44 平板菌落计数法 （2）稀释：用1mL无菌刻度吸管吸取1mL已充分混匀的10-1的样品稀释液，放入标记为10-2的含有9mL无菌水的试管中，此即为100倍稀释。将10-2试管置试管振荡器上振荡或在掌心中充分镇摇，使菌液充分混匀。也可以另取一支1mL吸管插入10-2试管中来回吹吸菌悬液三次，将菌体分散、混匀。用此吸管吸取10-2菌液1mL，放入10-3的试管中，此即为1000倍稀释。……其余依次类推，整个过程如图3-44所示。注意每次放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。 （3）取样：用三支1mL无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6的稀释菌悬液各1mL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放1mL，每个稀释度做2个平行样。 （4）倒平板：尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的营养琼脂培养基约15～20mL／平皿，迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。摇匀后水平放置。待培养基凝固后，将平板倒置于37 （5）计数：培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度二个平板上的平均菌落数。 一般选取菌落数在30 cfu～300 cfu之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30cfu的平板记录具体菌落数，大于300 cfu的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 （6）菌落计数数据处理 ① 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。 ② 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算： N——样品中菌落数； ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。 示例： 稀释度 1:100（第一稀释度） 1:1000（第二稀释度） 菌落数（cfu） 232，244 33，35 ===24727 上述数据修约后，表示为25000或2.5×104。 ③ 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 cfu，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 ④ 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 cfu，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 ⑤ 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落