鹅CAPN3编码区克隆、表达及其在肌肉生长发育中的作用研究.pdf

摘要 钙蛋白酶（Calpain,CAPN）作为影响肉嫩度的候选基因，在肌纤维生长发育和 降解过程中发挥着至关重要的作用。Calpain3 （CAPN3）是该家族的成员之一，在骨 骼肌中特异表达，已有研究结果表明，CAPN3活性与肌纤维种类、肌纤维的收缩等 密切相关，为此，我们推测CAPN3基因可能通过调控骨骼肌肌纤维生长发育从而影 响肉品质，但目前关于CAPN3在鹅骨骼肌中的表达模式尚未见报道，同时，CAPN3 在鹅肌骨骼肌生长发育过程中的表达调控机制也尚不清楚，这些问题都有待研究。为 此，本试验以四川白鹅和钢鹅为试验材料，首先通过基因克隆的方法获得鹅CAPN3 基因CDS 区序列，然后采用HE 染色法测定不同日龄鹅胸、腿肌肌纤维直径和密度， qPCR CAPN3 Cn-NFAT PPP3CA PPP3CB 利用 检测 基因和 信号通路相关基因 、 、 PPP3R1 在不同生长发育阶段肌肉组织中的表达情况，并分析了其表达量与肌纤维性 状的关联性；最后在细胞水平上，通过在骨骼肌卫星细胞中干扰和过表达CAPN3基 因，检测鹅肌肉生长发育过程中Cn-NFAT信号通路相关基因的mRNA 变化情况，初 步探讨了CAPN3基因在鹅骨骼肌生长发育中的作用。主要研究结果如下： （1）首次获得鹅CAPN3基因CDS 区序列2316bp，该序列编码771 个氨基酸， 分子质量为89.019kDa。序列比对表明，四川白鹅的CAPN3与日本鹌鹑、火鸡、珍 珠鸡、鸭、鸽、鸡的CAPN3氨基酸序列的相似度达到90%以上。系统进化树分析表 明，鹅CAPN3与鸟类有密切的遗传关系和较小的进化距离。 （2）在胸肌中，两品种鹅CAPN3基因的表达量均呈“波浪线”的变化趋势。品 种间对比发现，在不同胚龄（日龄）点，CAPN3mRNA 在四川白鹅胸肌中的表达量 均明显较高于钢鹅（P0.05）。腿肌中，CAPN3基因在两品种鹅发育过程中的表达量 均呈“先上升后下降”的趋势。品种间对比发现，在不同胚龄(日龄)阶段，钢鹅在腿 肌中的表达量均明显高于四川白鹅（P0.05）。 （3）两品种鹅CAPN3 基因mRNA 表达量与其肌纤维性状均呈不同程度的线性 相关。在胸肌中，无论四川白鹅，还是钢鹅CAPN3mRNA 的表达量与其肌纤维密度 均呈显著或极显著的正、负相关关系（P0.05，P0.01）。在腿肌中，四川白鹅CAPN3 mRNA 的表达量与其肌纤维密度呈显著负相关水平（P0.05），而钢鹅CAPN3mRNA 的表达量与其肌纤维直径呈现极显著负相关水平（P0.01）。 4 PPP3CA （）四川白鹅和钢鹅 基因在胸肌中的表达均呈“先升后降”的趋势，而 I 在腿肌中呈不同的表达模式。品种间比较发现，在E15、E22、49d 和70d 时，钢鹅 在腿肌中的表达量均显著高于四川白鹅(P0.05)。四川白鹅和钢鹅PPP3CB 基因在胸 肌中的表达均呈“降-升-降-升”的趋势，而在腿肌中的表达趋势一致。品种间比较发 现，在不同胚龄（日龄）点，钢鹅PPP3CB 基因在腿肌中的表达量均显著高于四川白 鹅(P0.05)。无论在胸肌或腿肌中，钢鹅PPP3R1 基因的表达量均显著高于四川白鹅 (P0.05)。 （5）鹅PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1 基因与其肌纤维性状均呈不同程度的线性 相关。两个品种鹅腿肌PPP3CA 基因的表达与肌纤维直径和肌纤维密度呈正相关，但 均未达到显著水平；两个品种鹅腿肌PPP3CB 基因的表达与肌纤维直径呈显著负相关 P0.05 P0.01 PPP3R1 （ ），而与肌纤维密度呈极显著正相关（ ）。两个品种鹅腿肌 基 因表达量与肌纤维密度呈显著正相关（P0.05）。 6 CAPN3mRNA PPP3CA PPP3CB （）两