三个稻曲病菌效应子的功能研究.pdfVIP

摘 要 水稻稻曲病是一种真菌病害，由稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）引起，其 主要危害水稻穗部，在水稻成熟期在穗部形成稻曲球，稻曲球膨大破裂后会散生 墨绿色粉末，从而污染健康谷粒。而稻曲球本身会产生毒素，人畜食用后会产生 中毒反应。最近几十年，稻曲病已逐渐从次要病害上升为水稻的主要病害，而水 稻是世界三大粮食作物之一，对人类至关重要。于是近年来，研究机构和学者对 稻曲病的关注也越来越多。但是这些研究大多集中在对稻曲病生物学特性，宿主 及侵染循环等的研究，很少有关于稻曲病的致病分子机理方面的研究。 我们前期的研究发现在被稻曲病菌侵染的水稻颖花中，小花授精灌浆被阻断， 但在灌浆相关基因RISBZ1 等被激活表达，暗示稻曲病菌通过激活灌浆系统而劫 持水稻营养库。进一步通过本生烟瞬时表达系统筛选出三个效应子 Uv_3667 ， Uv_3 746，Uv_ 7360 对 RISBZ1 的启动子具有激活作用。本论文在此基础上进行 更深入的研究，以期揭示这几个效应子的生物学功能，并验证其与灌浆相关基因 RISBZ1 之间内在联系，主要取得了如下进展： （1）通过生物信息学分析发现，Uv_3746 蛋白结构域第1~19 位氨基酸区域 为信号肽区域，第51~ 148 位氨基酸区域为预测的微生物核糖核酸酶类。Uv_3667 蛋白结构域第1~23 位氨基酸区域为信号肽区域，第28~85 位氨基酸区域为预测 的疏水蛋白。Uv_7360 蛋白结构域第1~19 位氨基酸区域为信号肽区域，第37~383 位氨基酸区域为预测的多种表皮生长因子样蛋白质。 （2 ）通过基因表达模式分析，发现接种后4 d 和10 d 时Uv_3667 的表达量 达到两个峰值，在4 d 时为最大峰值；接种后5 d 和11 d 时Uv_3746 的表达量达 到两个峰值，在11d 时为最大峰值，说明在稻曲病菌进入水稻小穗初期时，效应 子Uv_3667 和Uv_3746 可能发挥作用。接种后8 d 和12 d 时Uv_7360 的表达量 达到最大值，并且 Uv_7360 的表达量整体高于Uv_3746 和 Uv_3667，说明效应 子 Uv_7360 可能在侵入水稻小穗后才发挥作用，且 Uv_7360 属于高度诱导表达 基因。 （3 ）通过本生烟亚细胞定位，结果显示效应子Uv_3667 主要定位在细胞质 和细胞核中；Uv_3746 的荧光与细胞内的质体重合度很高，说明Uv_3746 定位于 I 质体上；Uv_7360 在本生烟细胞中呈点状分布，且不与质体和细胞核共定位。 （4 ）将三个效应子在水稻 ZH11 中异源表达，并对异源表达水稻进行稻曲 菌PJ52 人工接菌，结果表明三个效应因子中只有Uv_3746 异源表达水稻接种稻 曲菌后，发病率显著高于野生型ZH11 ，说明Uv_3746 在水稻中表达能促进稻曲 病菌致病。而 Uv_3667 和 Uv_7360 转基因水稻发病率较野生型ZH11 没有显著 性差异。利用RT-qPCR 检测灌浆相关基因的表达，结果表明，在异源表达Uv_3746、 Uv_3667 和Uv_7360 的转基因水稻破口前的颖花中，灌浆相关基因AGPL2 的表 达被明显抑制，而其他灌浆相关基因没有明显趋势。在叶片中，Uv_3746 转基因 材料的灌浆相关基因RPBF 、SSI 、AGPL2 、Glutlin1、Glutlin2 的表达都有明显上 调趋势。 （5）对三个效应子在水稻中异源表达材料成熟种子的总蛋白和可溶性糖含 量测定，结果显示可溶性糖的含量均显著低于野生型材料 ZH11，而总蛋白没有 明显差异。农艺性状调查结果表明，三个效应子转基因材料的株高与对照相比没 有明显差异，但千粒重比对照高。而其他指标如穗长、每株实粒数、有效分蘖数 等，在不同株系间存在较大差异，没有明显一致趋势，因此需要进一步重复调查。 （6）为明确三个效应子在稻曲病菌中的功能，我们对其进行过表达和基因 敲除研究，目前成功获得 Uv_3667 和 Uv_7360 的稻曲菌过表达转化子，初步结 果表明，Uv_3667 和 Uv_7360 的过表达转化子在PSA 培养基上对菌落生长影响 不明显，在CA 培养基上能促进菌落生长，不论碳源是水苏糖、蔗糖还是葡萄糖。 在应对胁迫条件时（包括刚果红、SDS、H2O2 、NaCl