病理检验技术 （一）组织的特殊染色 酶类—三磷酸腺苷酶.pptx

病理检验技术特殊染色 酶类三磷酸腺苷酶三磷酸腺苷酶三磷酸腺苷酶( adenosine triphosphatase)为一种水解酶,它水解底物三磷酸腺苷为二磷酸腺苷和磷酸,同时产生能量。碱性磷酸酶也能催化这种反应,但所需的pH不同,这可避免碱性磷酸酶存在所引起的非特异性染色。经甲醛液固定的组织,酶活性受到一定抑制甚至灭活。 三磷酸腺苷酶三磷酸腺苷酶根据所用激活剂和抑制剂的不同以及酶定位的不同分为以下三类：1.膜性三磷酸腺苷酶又称钠/钾离子激活三磷酸腺苷酶2.肌球蛋白三磷酸腺苷酶3.线粒体三磷酸腺苷酶 三磷酸腺苷酶一、镁激活法(根据 Dachstein和 Meisel) （一）试剂配制1. 0.125%的三磷酸腺苷二钠盐2. 0. 1mol/L三羟甲基氨基甲烷/失水苹果酸缓冲液(pH7.2)3. 0.1mol/L硫酸镁4. 2%的硝酸铅5. 孵育液6. 1%的硫化铵 即配即用,不能保存 孵育液：0.125%的三磷酸腺苷二钠盐 4ml 0.lmol/L三羟甲基氨基甲烷/失水 苹果酸缓冲液(pH7.2) 4.4ml 0.1mol/L硫酸镁 1ml 2%的硝酸铅 0.6ml 依次充分混合,必要时用0.2mol/L 氢氧化钠调至pH7.2,用前过滤。三磷酸腺苷酶(镁激活法(根据 Dachstein和 Meisel))(二)染色步骤1. 新鲜组织低温恒冷切片(用液氮快速冷冻效果更佳),厚6μm,贴于玻片,取出风扇吹干30分钟。2. 切片浸入预温至37℃的孵育液于37℃恒温箱解育10~60分钟。3. 蒸馏水洗2次,每次1分钟。4. 1%的硫化铵处理1分钟。5. 流水冲洗5分钟。6. 常规脱水透明,中性树胶封固。 三磷酸腺苷酶(镁激活法(根据 Dachstein和 Meisel))(三)结果镁激活的三磷酸腺苷酶活性处呈棕黑色,在肝毛细胆管该酶呈树枝状分布。 图 镁激活法肝组织,毛细胆管内三磷酸腺苷酶活性处呈棕黑色 三磷酸腺苷酶(镁激活法(根据 Dachstein和 Meisel)) (四)对照方法配孵育液时,用等量蒸馏水代替0.125%的三磷酸腺苷二钠盐,结果应为阴性。三磷酸腺苷酶(镁激活法(根据 Dachstein和 Meisel))(五)注意事项1.三磷酸腺苷酶经固定后活性大受影响,因而切片不经固定。2.配制孵育液时,当最后加入硝酸铅液后会形成乳样混浊, 过滤后如澄清则可以使用。3.孵育时间动物组织一股孵育10~30分钟,人体组织需延长孵育时间至60分钟甚至120分钟。4.1%的硫化铵配后不久会自行分解而失效,因此每次要临时小量配制,一般取蒸馏水4ml加入硫化铵一滴即可。 硫化铵用后要塞紧保存,否则容易失效。三磷酸腺苷酶(镁激活法(根据 Dachstein和 Meisel))(六)染色机制三磷酸腺苷酶水解三磷酸腺苷为二磷腺苷和磷酸,并放出能量。磷酸与铅离子结合在酶活性处形成无色的磷酸铅,磷酸铅经硫化铵处理,便转化成棕黑色的硫化铅沉淀在酶活性处显色。三磷酸腺苷酶二、钙激活法(根据 Dubowitz和 Brooke)(-)试剂配制1.0.1mol/L巴比妥钠2.0.18mol/L氯化钙3.碱性前孵育液(pH10.4)4.酸性前孵育液0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH14.6)5.底物孵育液(pH9.4)6.2%的氯化钴7.1%的氯化钙8.0.01mol/L巴比妥钠9.1%的硫化铵即配即用,不能保存。三磷酸腺苷酶(钙激活法(根据 Dubowitz和 Brooke))(二)染色步骤1.新鲜组织低温恒冷切片(用液氮快速冷冻效果更佳),厚6μm,连续切片分别贴于2张玻片上,风扇吹干30分钟。2.先取1张切片,浸入碱性前孵育液(pH10.4)，室温孵育15分钟。3.后取另1张切片,浸入酸性前孵育液(pH4.6)室温孵育5分钟,然后再浸入碱性前孵育液(pH10.4)洗30秒。4.将上述两张切片转入底物孵育液(pH9.4)于室温孵育30~45分钟。5.1%的氯化钙浸洗3次,每次约3分钟。6.2%的氯化钴处理3分钟。7.0.01mol/L巴比妥钠充分洗4~5次,每次1-2分钟。8.流水冲洗1分钟。9.1%的硫化铵处理1分钟。10.充分水洗10分钟。11.常规脱水透明,中性树胶封固。三磷酸腺苷酶(钙激活法(根据 Dubowitz和 Brooke))(三)结果图 钙激活肌肉组织,三磷酸腺苷酶呈黑色三磷酸腺苷酶(钙激活法(根据 Dubowitz和 Brooke))(四)注意事项1.肌肉组织切片用异戊烷-液氮冷冻法较佳,方法是:把液氮倾入保温瓶内(约半瓶)，将异戊烷( isopentane)倒入一个50m1烧杯内(约半烧杯),烧杯事前应以铁线箍牢并具一柄以利握