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Westernblot 基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基， 加入预冷的 PBS 洗一遍，加入的 RIPA 裂解液（含 1mMPMSF(100× )，每 10ml 加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂 各 一 片 ， 六 孔 板 每 孔 150-250μl， 60mm× 15mm 培 养 皿300-400μl，），于冰上裂解约 5 分钟，裂解总液 12000rpm 离心 10min。取上清，用 BCA 法测定蛋白浓度。用于 westernblot 的蛋白样品取一定量加 4×loadingbuffer ，10×reducing，再用裂解液 补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将 EP 管于沸水中煮 5min ，变性，之后再离心后准备上样。 二、 BCA  法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（ BSA ），配制成 5mg/ml 的蛋白标准溶液， 10μl分装， -20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品， 取 10μl用 PBS 稀释至 100μl，使终浓度为 0.5mg/ml 。 据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B(50:1) 配制适量 BCA 工作液，充分混匀。 BCA 工作液室温 24 小时内稳定。 将标准品按 0,1,2,4,8,12,16,20 加μl到96 孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到 20μl。 加适当体积样品到 96 孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加 PBS 到 20μl。 各孔加入 100μlBCA 工作液， 37℃放置 30 分钟。 测定 580nm 条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、 Westernblot 基本操作步骤 1、溶液配制： RunnigBuffer(1 ×)：SDSRunnigBuffer （20×）50mL ，加 MiliQ 水至 1L ； ②TransferBuffer(1 ):TransferBuffer(10× )100mL,× 甲醇 200mL（20%， v/v ），加 MiliQ 水至 1L ； TBST 缓冲液 1MTris ·HCl （pH7.6）：60.5gTris-base，加入约 30ml 浓盐酸， PH 至 7.6，加 MiliQ 水至 500ml。 TBS 缓冲液（ 10×）：1MTris ·HCl100ml+80gNaCl 加 MiliQ 水 1L TBST 缓冲液（ 1×）：TBS 缓冲液（ 10×） 100ml+0.5mlTween-20 0.05%， v/v ），加 MiliQ 水至 1L 。 ④封闭液： 5%BSA （5g/100ml ，称取 1gBSA 至 20mlTBST ，充 分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用 4×SDSloadingbuffer,10 reducing× 与蛋白质样品混合， 并将此 EP 管放在水浴锅中沸水煮 5min ，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满 RunnigBuffer(1 )，×内槽加入 0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量 20μg以上）。 向 marker 孔中加入 2.5μlmarker（按照实验要求设定 marker 量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液 (loadingbuffer) 。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止 体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳 将电泳装置与电源连接。 调节电压为 100-200V ，电泳 50min，直至溴酚兰接近分离胶的底部， 然后关闭电源并撤去连接的导线。 拆除电泳装置： 先倒掉电泳缓冲液， 连同槽一起将凝胶夹层取出，小心的撬起凝胶外层塑料板，使凝胶暴露出来，切去浓缩 胶以及无蛋白样品的凝胶部分（将胶留在短的一面塑料板上） 。 4、转膜（湿转） ①将转膜液（ 1×TransferBuffer ）放于大饭盒内，泡 4 片海绵，剪 4 片滤纸、 1 片 PVDF 膜，PVDF 膜于甲醇中活化 30s，取出置于 转膜液中； ②按照 2 层海绵 +2 层滤纸 +胶+膜+2 层滤纸 +5 层海绵（填满）的 顺序组装转膜装置，注意组装此装置时一定要保证滤纸、膜、凝 胶精确对齐并不留气泡； ③将组装好的装置放入电转槽，合上盖子，电转槽置于冰浴，接 通电源，调节电压为 15V ，时间为 16~18h（或恒流 300mA,3h ）。 显示红灯亮后，按下 Start 后，开始转膜。 转膜方向为蛋白从负极（黑色）转向正极（红色） 。 5、免疫印迹反应及化学发光检测 转膜完毕后， 根据目的蛋白分子量将膜剪成不同的条带， 用封闭液（ 5%BSA）室温封闭 2