mrna提取和荧光定量pcr.pptxVIP

RNA的抽提 一、概述 Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。二、试剂 1.DEPC水： 1ml＋1000ml双蒸水＝1‰ DEPC水，1000ml容量瓶中静置4小时。2.75%乙醇：无水乙醇+DEPC水，-20℃保存（DEPC水需先高压）3.氯仿：棕色瓶4.异丙醇：棕色瓶三、操作步骤一、抽提（一）组织抽提（二）细胞抽提1.倒掉培养基，PBS洗，直接将1ml Trizol 注入培养瓶（5×106），反复抽吸均匀。2.或收集细胞后加入Trizol 反复抽吸均匀。三、操作步骤二、分相3.在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿(为Trizol总体积的1/5),振荡混均30秒，室温下静置5分钟.4. 12000 rpm 15分钟4?C,分相为三层。上层：RNA(约为Trizol的60%)；中间：DNA；下层:蛋白质(酚-氯仿)。5.小心吸取上清液，转移到另一EP管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.4～0.6 ml。有机相和中间层