测定蛋白酶活力实验.pdf

测定蛋白酶活力实验 一、实验目的 1.加深了解酶活力的概念。 2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。 二、实验原理 酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下 酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成 量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单 位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。 实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪 氨酸在碱性条件下与 Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化 合物在 680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白 酶的活力。 三、仪器和试剂 仪器: 恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。 原料 枯草杆菌蛋白酶：称取 1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量 0.02mol/L， pH7.5 磷酸缓冲液溶解并定容至 100mL，震荡 15 分钟，使充分溶解， 干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀 释。 试剂 1. Folin-酚试剂： 在 2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠 (NaWoO . 2H O)100g，钼酸钠 2 4 2 (NaWoO . 2H O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL， 2 4 2 充分混匀后，微火回流加热 10 小时。再加入硫酸锂 150g，蒸馏水 50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸 15min，以驱赶过剩的溴。冷却后 加蒸馏水定容至 1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中 暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为 2mol/L)，然后加水稀释至 1mol/L，即可使用。 2. 0.2mol/L 盐酸溶液 3. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液 4. 0.55mol/L 碳酸钠溶液 5. 10%三氯乙酸溶液 6. 0.02mol/LpH7.5 磷酸缓冲液： 称取磷酸氢二钠(NaHPO . 12H O)7.16g，用水定容至 100mL(A 液)； 2 4 2 称取磷酸二氢钠(NaHPO .12H O)3.12g，用水定容至 100mL(B 液)。 2 4 2 取 A 液 84mL，B 液 16mL 混合后，得到 0.2mol/LpH7.5 磷酸缓冲液， 可长期存放。临用时稀释 10 倍即可。 7. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL)：称取 12.5mg 以烘干至恒重的酪氨 酸，用 0.2mol/L 盐酸约 30mL 溶解后，蒸馏水定容至 250mL。 8. 酪蛋白溶液 (0.5%)：称取 1.25g 酪蛋白，用 0.04mol/L 氢氧化 钠溶液(20mL)溶解，再用 0.02mol/LpH7.5 磷酸缓冲液定容到 250mL。 四、操作步骤 (一)酪氨酸标准曲线的制作 取 6 支试管 (标号 0，1~5)，按顺序分别加入 0.00，0.20，0.40， 0.60，0.80 和 1.00mL 标准酪氨酸溶液，再用水补足到 1.00mL，摇 匀后各加入 0.55mol/L 碳酸钠 5.0mL，摇匀。依次加入 Folin—酚 试剂 1.00mL，摇匀并计时，于 30℃水浴锅中保温 15min。然后680nm 处测定吸光值(以0 号管作对照)。以酪氨酸含量(μg)作横坐标，吸 光值为纵坐标绘制标准曲线。 ( )酶活力测定 1.酶反应：取一支试管，加入 2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，于 30℃水浴 中预热5 分钟，再加入 1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，立即计 时，水浴中准确保温 10min，从水浴中取出后，立即加入2.0mL 的 10% 三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液(样品液)。 另取一试管，先加入 1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0mL 的 10%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟，再加入 2.0mL0.5%的酪蛋 白溶液，然后于30℃水浴保温 10min，同样干滤纸过滤，收集滤液(对 照液)。 以上两过程，应各做一次平行实验。 2.滤液中酪氨酸含量的测定 取 3 支试管，分别加入 1.0mL 水、A 液、B 液