微生物实验思考题南京工业大学生物与制药重点项目工程学院.doc

试验一 细菌简单染色和细菌形态观察 试验原理 简单染色采取一个染料对菌体进行染色，常见结晶紫、美蓝、碳酸复红等碱性染料。染色后，菌体和背景形成鲜明对比，在显微镜下很轻易被识别。经过简单染色方法能够观察细菌菌体形态特征和菌体排列方法。 观察菌体形态 简单染色 （只用一个染料） 观察菌体排列方法 染色方法 革兰氏染色 判别 判别染色 抗酸性染色 （利用两种染料） 芽孢染色 观察特殊结构 荚膜染色 鞭毛染色 二、试验步骤： 涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检 三、思索题 制备细菌染色标本时，应该注意哪些步骤？ 答；（1）涂片：开始所加无菌水液滴不要太大，不然不易干燥； 取菌量要适宜且要涂抹均匀，避免过大造成堆积，而难以看清细胞个体形态 同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞。 （2）无菌操作取菌：一定要等接种换冷却后再取菌，以免高温使菌体变形； （3）干燥固定：干燥后加热固定，可避免加热时间过长，不然细胞会破裂或变形； （4）固定：菌膜一面朝上，经过酒精灯微火三次。注意温度不宜过高，时间不宜太长，不然菌体形态则会发生改变。 （5）水洗：倾去染色液后，用水沿着菌膜四面冲洗，注意勿使水流直接冲洗菌膜部位，水流不宜过急，过大，至流出水无色为止； 为何要求制片完全干燥才能用油镜观察？ 答：使用油镜时，物镜和标本间介质为香柏油（N=1.515），不仅增加了透明度，而且会提升了分辨率。 若制片不完全干燥后，就用油镜观察，则N会减小，分辨率D也会变小。而且还会造成油水两相不互溶，所以制片要求完全干燥后才能用油镜观察。 假如涂片未经加热固定，将会出现什么问题？假如加热温度过高，时间太长，又会怎样呢？ 答：加热固定作用是使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还能够杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态，而且还可增加细胞对染料亲和力。 （1）假如图涂片未经加热固定，则细胞无法固定在载玻片上，在染色水洗后会被水流冲走。 （2）假如加热温度过高，时间太长，则会使细菌形态发生改变甚至破裂。 为何细菌染色常见碱性染料？什么情况下用酸性染料？ 答：（1）细菌染色常见碱性染料，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中通常带负电荷，而碱性染料电离后染色部分带正电荷，很轻易和细胞结合使其着色。 （2）当细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采取酸性染料染色。 试验二 细菌革兰氏染色法 试验原理 革兰氏染色是细菌染色中关键判别染色方法之一。经过革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌(G-)。 G+和G-关键是因为细胞壁结构和化学成份差异引发脱色能力不一样。 ①结晶紫初染和碘液媒染:在细菌细胞膜内可形成不溶于水结晶紫和碘化合物。 ②乙醇脱色： 细胞壁较厚 结晶紫和碘液复合物留在细 G+ 胞壁内，使其保持紫色。 肽聚网层次多和交联致密且不含类脂 细胞壁较薄 结晶紫和碘复合物溶出，细 G- 胞壁退成无色 肽聚网层薄和交联差，外膜层类脂含量高 ③番红染色：G-细菌展现红色，而G+细菌则仍保留最初紫色。 试验步骤 立即水洗 水洗 干燥 结晶紫