微生物限度检查方法验证专项方案.doc

微生物程度检验方法验证方案 1.目标： 为确定所采取方法适合于该药品微生物程度检验，包含细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检验，特制订本验证方案，经过比较试验菌恢复生长结果，来评价整个检验方法正确性、有效性和重现性，以确定供试品在该试验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采取方法适适用于该品种微生物程度检验。? 验证过程应严格根据本方案要求内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组同意 2.范围： 本验证方案适适用于微生物程度检验方法验证。 3.规范性引用文件：? 依据《中国药典》20XX年版二部附录Ⅺ?J?微生物程度检验法要求，因为一些供试品含有抗菌活性，在建立微生物检验方法或产品组分发生改变或原检验法检验条件发生改变时，可能影响检验结果正确性，必需对供试品抑菌活性及测定方法可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1?试验前准备:? 4.4.1.1?试验用具准备：将试验需用试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30?min，在3天内使用。? 4.4.1.2试验用培养基制备：取适用性检验合格营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按摄影应配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15?min，在3周内使用。? 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液制备：取在使用期内试剂，按摄影应配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯800.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15?min，在3周内使用。??? 4.4.2?试验菌制备和稀释：? 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：? 4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～二十四小时；取白色念珠菌新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。? 4.4.2.1.2将上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均匀培养物（菌悬液），用0.9%无菌氯化钠溶液对倍稀释制成每1ml含菌50～100cfu试验菌液。在黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养基中，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯800.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱（菌悬液），用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯800.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌50～100cfu试验孢子液。? 4.4.2.1.3上述菌液在供试验同时，取1ml注皿、培养、计数；大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌用营养琼脂培养基，于30～35℃倒置培养48小时，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基，于23～28℃倒置培养72小时。? 4.4.2.2控制菌检验方法验证用菌液：? 4.4.2.2.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，生孢梭菌新鲜培养物少许接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中，在30～35℃培养18～二十四小时。? 4.4.2.2.2?取上述均匀培养物（菌悬液），用0.9%无菌氯化钠溶液对倍稀释，制成每1ml含菌10～100cfu试验菌液。? 4.4.2.2.3上述菌液在供试验同时，取1ml注皿、注入营养琼脂培养基，于30～35℃倒置培养48小时，计数。? 4.4.3供试液制备：? 4.4.3.1?依据供试品理化特征和生物学特征，采取适宜方法制备供试液。? 4.4.3.2，取供试品养胃舒软胶囊5g，加至含溶化（温度不超出45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物烧杯中，用无菌玻璃搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充足乳化，作为1：20供试液。? 4.4.3.3?供试液制备如需用水浴加温时，温度不得超出45℃，时间不得超出30min。?5.5.4细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方法:? 4.4.4.1?验证试验分4组，照《微生物程度检验法》操作，分别用3个不一样批号样品进行3次独立平行试验， 并分别计算供试品组和对照试验组菌回收率。? 4.4.4.2试验组：?? 4.4.4.2.1?平皿法：分1：20供试液1ml和试验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm灭菌平皿中，每株试验菌平行制备