基因工程药物蛋白的分离纯化与质量控制.pptxVIP

重组基因工程药物的分离纯化及质量控制; 基因工程药物特点: (1) 目的产物在初始原料中的含量较低; (2) 含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外, 还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特 别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；; (3) 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属离子、 有机溶剂、剪切力、表 面张力等十分敏感，容易是其失活、变性； 种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或 复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异 的生物活性物质； 应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求 无菌、无热源。 ; 目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。 ;建立分离纯化工艺的根据 1、含目的产物的起始物料的特点 利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。 （1）菌种类型及其代谢特性：包括菌种的生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等； （2）原材料和培养基的来源及其质量； ;（3）生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式 （连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工 艺控制条件因素几方式等； （4）初始物料的物理、化学和生物学特性：包括产物浓 度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解 度、pH、黏度、流体力学性质和热力学性质。 2、物料中杂质的种类和性质 物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。;3、目的产物特性 产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。 4、产品质量的要求 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。;特别注意3类可能存在的非蛋白质类杂质： （1）DNA的去除：在利用离子交换时，控制样液的pH值，使DNA不被吸附，而蛋白质可以被吸附；或利用亲和层析；;（2）热原的去除：热原主要是肠科杆菌科所产生的细胞内毒素，在细菌生长或细胞溶解时会释放出来，主要是细胞壁成份－脂多糖，其性质相当稳定，即使经高压灭菌也不失活。注射用药必须无热原。 从蛋白质溶液中除去内毒素比较困难，最好的办法是防止产生热原，整个生产过程要在无菌条件下进行，所有层析介质在使用前都要先除去热原，在2~8℃下进行操作。洗脱液需先经过无菌处理，流出的蛋白质溶液也应无菌处理，即经过0.2μm滤膜过滤。 脂多糖带负电，可以用阴离子交换层析法去除；是疏水的，也可以用疏水层析法。; 基因工程药物分离纯化的一般流程;A 重组基因工程药物分离纯化方法选择的基因原则;针对不同的产物表达形式采取不同的策略;针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型;多种分离纯化技术的联合运用;合适分离纯化介质的选择;分离纯化过程的规模化;比较指标 ; 分离纯化技术要求： （1）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性； （2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数； （3）收率要高； （4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤； （5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。;一是破碎抽提，即把蛋白从材料转入溶剂中制成蛋白质溶液； 二是纯化，即把杂质从蛋白质溶液中除掉或从蛋白质溶液中把蛋白质分离出来； 三是制剂，即将蛋白质制成各种剂型。 根据蛋白本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题: (1)要注意防止蛋白的变性失活. (2)蛋白的分离纯化的目的是将目标蛋白以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需蛋白的条件下，可使用各种“激烈”的手段。;蛋白的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白. (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。 (3) 均质蛋白 (homogeneous): 目标蛋白的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。;细胞结构