《反向遗传学及其相关技术》.pptVIP

来源不同：siRNA来源于转基因或病毒RNA，由长dsRNA转变而来；miRNA来源于内源转录本，是细胞内RNA的固有组分之一，由具有发夹状结构的pre-miRNA转变而来； 结构不同：siRNA主要以双链形式存在，其3’端存在2个非配对的碱基，通常为UU；miRNA主要以单链形式存在； 对靶RNA 的特异性不同： siRNA与靶mRNA完全互补配对结合；miRNA与靶RNA并不完全互补，存在错配现象。靶序列有一个核苷酸突变，就会影响到siRNA的作用功能，但不会影响到miRNA的功能； 作用形式不同：siRNA主要在转录后通过降解mRNA发挥作用，而miRNA只在蛋白质翻译水平上负调控靶基因的表达。 不同点: （四）、RNA干扰的研究方法 一般技术路线 （五）、RNA干扰的应用 1.基因功能研究 由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。 已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。 与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。 2.病毒性疾病的治疗 使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。某研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5（化介素受体， HIV-1的辅因子）进入人体外周Ｔ淋巴细胞，而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。 ——艾滋病 2.病毒性疾病的治疗 Shlomai和Shaul设计了各针对HBV基因19nt的两种pSUPER载体：pSUPER X-siRNA和pSUPER core-siRNA。已转染含1.3 X wt HBV基因质粒载体的Huh7细胞再被 X-siRNA或 core-siRNA转染后，core蛋白水平分别降低了89%、63%，转染X-siRNA的细胞中HBsAg降低60%，但转染core-siRNA对HBsAg表达无明显影响（X-siRNA干扰沉默了所有的病毒转录物，而core-siRNA仅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）。 —— HBV（乙肝病毒） 2.病毒性疾病的治疗 Randall等证明了针对HCV RNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCV RNA降低80倍；将siRNA 转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默HCV RNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等 也证明了siRNA特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。 —— HCV（丙肝病毒） 2.病毒性疾病的治疗 RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。 严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的防治研究，RNAi也受到了重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的治疗。 ——脊髓灰质炎病毒/SARS 3.肿瘤治疗 用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。 (1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因。 (2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达。 (3)RNAi可应用于抑制基因扩增。 Li等在3个肝癌细胞系Hep3B、HepG2、SNU449中对cyclin E的研究中发现，转染siRNA组48 h后生长抑制均达到90％，而对照组无作用，3天后凋亡率分别为16％ 、44％和3l％，而对照组仅为l％。 3.肿瘤治疗 Survivin基因是迄今为止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成员，可通过抑制caspase级链反应下游的caspase3，caspase7发挥其抗凋亡作用。现在研究已证实survivin基因参与了肝癌的发生与发展，并且还与化疗的耐药性相关。降低survivin基因在肝癌细胞中的表达不仅可诱导肝癌细胞的凋亡、抑制肝癌细胞的生长，还可增强其对化疗的