《基因克隆与表达》.pptVIP

凝胶板剥离与染色 电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1-2小时左右。 脱色：染色后的凝胶用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质条带清晰。 结果分析 标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。 以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。 * * 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（简称：辅酶Ⅰ，英语：Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）在生物氧化过程中起著传递氢的作用，能活化多种酶系统，促进核酸、蛋白质、多糖的合成及代谢，增加物质转运和调节控制，改善代谢功能。 基因克隆与表达 目的基因-T 表达载体 酶切， 胶回收，连接 转化到克隆用细胞（Top10) 提质粒，酶切验证 转化到表达用细胞（BL21（DE3)） 诱导表达 SDSDNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 1）. DNA的纯度 ?影响限制性内切酶活性的因素 2）. DNA的甲基化程度 dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。 3）. 温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。 是影响限制酶活性的重要因素。 4）. 缓冲液(Buffer) 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定； β－巯基乙醇：保持酶的稳定性，防止酶失活。 用时在冰上操作； 取酶用干燥、灭菌、新的枪头 酶用量不能超过酶切总体积的10%； 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲液； 关心小贴士告诉你 ? 使用时注意事项： 连接、转化与重组子鉴定 1、连接 （1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA 3’ 端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+ （2）. 连接条件 ? ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，连接缓冲液宜分装； ?单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； ? PEG：5%以下可以提高连接效率 ?连接效果最好在37 ℃，但形成的互补不稳定; ?最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连接效果，互补又较稳定; 2）连接温度： 3）反应液中的成分： ?目的或作用： 4）插入片段与载体的浓度比例 ?载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通常为1﹕3左右，甚至1﹕10 或更高。 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。 化学法（CaCl2法)： 转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。 2、转化 影响转化率的主要影响因素: ? 载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高； ? 插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低； ? 受体细胞的类型及预处理； ? 转化方法：电击法高于化学法。 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r pBR322 4363 bp ori ? 限制性酶切图谱法 3、转化子的筛选和鉴定 质粒DNA的提取 基因组DNA 质粒DNA ?质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。 ?质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 ⅰ质粒DNA提取方法： 碱裂解法、煮沸法、 SDS法等 ⅱ 碱裂解法原理： 在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。 ⅲ 抽提出质粒的构型： 1）超螺旋质粒D