《基因工程原理与技术-5》.pptVIP

基因工程原理与技术-5 第一节 PCR原理 ①遵循DNA体内复制原理，半保留式扩增； ②扩增序列取决于设计一对引物(正向引物、反向引物)，有效扩增长度为2kb左右； ③扩增循环包含变性、退火、延伸3个阶段； ④30~35个循环后，目标序列呈指数级扩增(2n-2) Cycle #1 第二节 PCR反应体系 一、反应体系 20μl 反应体系 10×buffer(Tris-HCl、KCl、Tween20、明胶、牛血清蛋白) dNTP(各20~200 μ mol/L) 模板DNA (0.1~2 μg=105个分子) 引物(各20~200pmol) MgCl2(0.5~2.5mmol/L) Taq DNA聚合酶(1~2.5U) 无菌ddH2O 二、反应参数 预变性：94℃ 3~5 min 变性： 94℃ 30~60 S 退火： 38~65℃ 30~60 S 延伸： 72℃ 1~2 min 终延伸： 72℃ 10min 30~35次循环 三、影响PCR的因素 1、反应成分 ①引物；浓度、长度 ②DNA聚合酶；种类(Klenow酶、Taq酶、Pfu酶)、用量 ③dNTP；浓度、比例 ④Mg2+；影响Taq DNA聚合酶的活性和真实性、引物退火、模板解链温度、产物的特异性、引物二聚体生成等。 ⑤反应缓冲液；pH8.3，KCl能促使引物退火、但浓度大于50mmol/L抑制酶活性。 ⑥模板DNA。用量，线性DNA扩增效果大于环状DNA。 2、反应条件 ①变性的温度和时间；热启动降低非特异性扩增 ②退火的温度和时间；取决于引物的长度、浓度和碱基组成，退火温度为Tm-5℃。退火温度越高，扩增特异性越高。 ③延伸温度和时间。延伸时间长短取决于目标序列的长度、及延伸温度的高低。对2 kb长目标序列扩增时间多采用 1min(72 ℃时)。 四、平台效应 平台效应是指PCR反应后期扩增产物不再随循环次数而明显上升、反应曲线变得平坦的现象。 引起平台效应的因素： ①dNTP或引物等消耗殆尽； ②酶活性逐渐降低； ③最终产物的阻化作用(焦磷酸盐、双链DNA)； ④非特异性产物与模板的竞争作用； ⑤在高产物浓度下产物变性不完全； ⑥低浓度的非特异产物开始大量扩增。 PCR的特点： ①灵敏度高 ②简便、快速 ③对样品纯度要求低 第三节 聚合酶链式反应引物设计原则 一、引物设计的总原则 提高特异性扩增，降低非特异性扩增。 二、引物设计的一般原则 ①引物长度应为15~30个核苷酸，Tm接近72℃较佳； Tm＝(G＋C)×4＋(A＋T)×2 ②引物中碱基分布应是随机的，避免出现一连串单一碱基以致产生二级结构； ③G＋C碱基的含量在 45％~55％左右； ④引物3’端必须与模板互补，5’端可以不互补 ⑤引物中连续互补碱基应小于4个； ⑥引物间连续互补碱基应小于4个。 三、引物3’端的末位碱基 引物3’端的未位碱基：优选A，其次是G、C，不要选T。因为当未位碱基为T时，即使在错配的情况下也能引发链的合成；而未位碱基为A时，错配时的引发效率大大降低；若为G或C，则引发率居于其间。当然，设计简并引物时，3’端末位碱基选T会得到较好的效果。 四、引物设计软件 Oligo6.57 Primer 5.0 第四节 PCR的类型 一、已知DNA序列的PCR扩增 1、巢式PCR 不受平台效应限制，扩增灵敏度增加1000倍， 引物1 引物2 25个循环 引物3 引物4 25个循环 2、热巢式PCR 第二对引物之一标记放射性物质，电泳检测时灵敏度增高，可测出106个细胞中的一个 DNA分子。 3、半巢式PCR (见下图) 引物1 引物2 25个循环 25个循环 引物1 引物3 4、不对称PCR 采用两种不同浓度的引物(50:1 )。 主要用于制备DNA测序的单链模板以及制备杂交探针。 高浓度引物 低浓度引物 5、等位特异性PCR 用于检测点突变。在引物的 3’端设计了突变碱基，突变引物与正常模板间扩增受阻，电泳分析时，不出现谱带，反之则会出现特定谱带。但有些错配碱基