《基因工程菌培养》.pptVIP

生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。 企业中进行重组菌培养时的设备标准有LS-1和LS-2。LS-2相当严格，工业生产起码应在LS-1的设备标准下培养。LS-1标准要点是：(1)使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置； (2)培养装置的排气由除菌器排出； (3)使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。设计用于基因重组菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂菌的侵入，还要防止重组菌的外漏。此外，培养后的菌体分离、破碎等处理也必须在安全柜内进行，或是采用密闭型的设备。 在普通通气搅拌罐中可能发生外漏的部位和操作。归纳起来有： 排气， 机械密封， 接种， 取样， 培养后的灭菌(通入湿热蒸气)， 排液(输至下一工序)。 基因工程菌发酵的后处理技术 传统的发酵产品和基因工程产品在提取和精制上的不同，主要表现在下列方面： (1)传统发酵产品多为小分子，其理化性能，如平衡关系等数据都已知，因此放大比较有根据；相反，基因工程产品都是大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。 （2）基因工程产品大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎，增添了很多困难。而且发酵液中产物浓度也较稀，杂质又多，加上一般大分子较小分子不稳定(如对剪切力)，故提取较困难，常需利用高分辨力的精制方法，如色层分离等。 （3）基因工程产蛋白提取的要求纯度更高，对于安全性的要求更为严格。 细胞的破碎 蛋白质的浓缩与分离 基因工程菌高密度发酵技术是基因工程技术生产应用的基础,其产品在化工、食品、环保、医药等方面都存在极大的潜在能力。但能否实现高密度培养及高目标产物浓度,是工程菌能否以较低成本实现规模生产的决定性因素。因此,必须结合高密度发酵的各个工艺条件,简化操作工艺,降低工业成本,最终使目标产物生产的规模化和产业化得以实现。 基因工程菌培养 什么是基因工程菌？ 为什么要构建基因工程菌？ 遗传性状的改良 代谢途径的加工 生物反应器 基因工程菌的构建 宿主菌：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济, 是应用最广泛,最成功的表达体系 外源基因：质粒 基因工程菌生长的特点： 外源基因与宿主的互相影响 产物，资源的争夺 基因工程菌与普通微生物发酵有什么区别？ 微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标。 基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质。 基因工程菌发酵的设备 气升式发酵罐的优点： 结构简单，不易污染，能耗低，操作简单，低剪切力, 适合高浓度发酵。 基因工程菌往往对剪切力更为敏感（why？） 基因工程菌的高密度发酵 在基因工程菌的发酵中，菌体的增殖和产物的表达都是在对数期内完成的，因此，发酵工艺的改进就集中在如何延长工程菌的对数生长时间，缩短衰亡时间 高密度发酵工艺是基因工程菌发酵的主要生产工艺 高密度发酵 培养基的要求 高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,需投入几倍于生物量的基质以满足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要。 成分的要求：使用甘油的原因？ 浓度的要求 在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提高 。 比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(ＧＳＨ)时,在发酵开始和进行12ｈ后,各添加2.0ｇ/Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴＰ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前体氨基酸,可以使细胞浓度和ＧＳＨ的产量分别比不添加这两种物质提高24%和1.4倍 培养方式 分批补料培养方式 补充营养 稀释代谢产物 分离与培养耦合 固定化培养技术 固定化技术与连续培养，透析培养相结合是基因工程菌发酵的发展方向 接种量的控制 接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生长影响较明显。接种量小(0.5%～4%)时,比生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量大(8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续生长时间短,自溶也较快。 接种量过小，延迟期太长 较接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。 发酵中溶解氧的控制 纯氧？富氧！ 添加提高传氧能力的VHb蛋白，添加H2O2，血红蛋白，小球藻。 溶氧过高或局部过高，会使某些微生物氧中毒 pH值的控制 在高密度发酵条件