SDS-PAGE电泳实验步骤.docxVIP

一、实验目的 学习 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS— PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的 pH 条件下解离而带电荷。当溶液的 pH 大于蛋白 质的等电点 (pI) 时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的 pH 小于蛋 白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动 的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度 等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三 维网状孔结 构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的 两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程 度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在 通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时， 分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的 区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶 ( 浓缩胶 ) 和下层 胶 ( 分离胶 ) 时，采用两种缓冲体系；上层胶 pH=—，下层胶 pH＝； Tris — HCI 缓冲 液中的  Tris  用于维持溶液的电中性及  pH，是缓冲配对离子；  CI - 是前导离子。在时， 缓冲液中的 Gly - 为尾随离子，而在 pH＝时， Gly 的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间 pH 的不连续性， 控制了慢离子的解离度， 进而达到控制其有效迁移率之目的。 不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不 同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效 应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠 (SDS) ，由于 SDS 带 有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如 巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与 SDS 充分结合，形成带负电性的蛋白质— SDS 复合物；此时，蛋白质分子上所带的负 电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量， 掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。 蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁 移率之间的关系是： r -b · m r m M =K(10 ) logM =LogK — b· R ， 式中 M r ——蛋白质的分子量； logK ——截距； b——斜率； Rm ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在 15,000 — 200,000 的范围内，电泳迁移率与分子量 的对数之间呈线性关系。 蛋白质的相对迁移率 Rm＝蛋白质样品的迁移距离／染料 ( 溴 酚蓝 ) 迁移距离。这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应 的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子 量。 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS) 法测定蛋白质的分子量具有简便、 快速、 重 复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。 三、试剂及主要器材 1．主要试剂 标准蛋白混合液 内含：兔磷酸化酶 B(Mw 97,400) ，牛血清蛋白 (Mw 66,200) ，兔肌动蛋白 (Mw 43,000) ， 牛磷酸酐酶 (Mw 31,000) 和鸡蛋清溶菌酶 (Mw 14,400) 2)30 ％ 凝 胶贮 备 液 ：丙烯 酰 胺（ Acr ） 29.2g ， 亚甲 基 双 丙烯 酰 胺 （ Bis ） 0.8g, 加双蒸水至 100mL。外包锡纸， 4℃冰箱保存， 30 天内使用。 3) 分离胶缓冲液／ L): Tris 18.17g, 加双蒸水溶解 ,6mol/L HCl 调 , 定容 100mL。 4℃ 冰箱保存 4) 浓缩胶缓冲液／ L): Tris 6.06g, 加水溶解， 6mol/L HCl 调，并定容到100mL。 4℃冰箱保存 5) 电极缓冲液： SDS lg ， Tris 3g ， Gly 14.4g ，加双蒸水溶解并定容到 1000mL。4℃冰箱 保存。 6)10 ％ SDS，室温保存 质量浓度 10％过硫酸铵 ( 新鲜配制 ) 8) 上样缓冲液：／ L Tris-HCl ，甘油 2mL， 10％ SDS 2mL，β - 巯基乙醇 1mL，％ 溴酚蓝，加蒸馏水定溶至 10mL。 9) ％考马斯亮蓝 R-250 染色液： 0.25g 考 马 斯 亮 蓝 R250，加 入 91ml50% 甲 醇 ，