真核细胞RNA的提取及电泳分析 .ppt

真核细胞RNA的提取及电泳分析 实验目的 掌握一种真核细胞RNA的提取方法 熟悉RNA的琼脂糖凝胶电泳检测分析 实验原理 rRNA,80～85% tRNA,10～15%，约5S/70-120nt mRNA,1～5% ，长短不一 28S，4700 nt 18S，1900 nt 5.8S，160 nt 5S，120 nt 哺乳动物细胞总RNA: 真核细胞RNA分布于胞质75%、胞核10%、细胞器15% 实验原理 Trizol试剂是由苯酚和异硫氰酸胍等组成的单相、快速抽提总RNA的试剂。 十二烷基肌氨酸钠：破细胞膜及核膜，释放RNA、DNA和蛋白。 异硫氰酸胍：RNase 抑制剂，抑制内源性RNase。 苯酚：使蛋白变性。 实验原理 当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，离心后形 成水相层和有机相层。RNA位于水相，而DNA和蛋白质位于分界层和有机相。 水相中RNA在高盐和有机溶剂共存时沉淀分离。 提取的RNA可用于Northern杂交、mRNA分离、cDNA合成、RT-PCR。 实验试剂 RNAiso Blood 氯仿 异丙醇 75%乙醇（DEPC处理水配制） RNase-free水 微量移液器 台式微量离心机 电泳槽 凝胶成像系统 主要仪器 电泳仪 实验步骤 取0.25 ml血液样品移至离心管中，添加 0.75 ml RNAiso Blood。 用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解。 加入 0.2 ml氯仿，混匀至溶液呈乳白色。 室温静置 5 分钟。 12,000×g、4℃离心 15 分钟。 吸取上清液移至新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。 向上清中加入等量体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，室温下静置 10 分钟。 12,000×g、4℃离心 10 分钟，试管底部会出现 RNA 沉淀。 弃上清,加入等量的 75％乙醇，振荡清洗沉淀后，7,500×g、4℃离心 5 分钟，弃上清。 室温干燥沉淀2~3分钟，加入30 μl RNase-free 水溶解沉淀。 取5 μl电泳检测，剩余-70℃保存。 注意事项 RNase（核糖核酸内切酶）生物特性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用不需辅助因子，存在十分广泛，本实验的关键是创造一个无RNase的环境，减少RNA的降解。 注意事项 去除外源性RNase的污染，包括操作者、工作环境、试剂及耗材等环节 戴口罩和手套，少少说话； 工作台面洁净，可用3%H2O2擦洗，空气中无灰尘； 离心管、Tip等塑料品用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液浸泡12h，后高温高压灭菌处理； 玻璃或陶瓷制品可180~250℃干烤8~4h; RNA溶解水溶液用DEPC处理过，后高温高压灭菌使用（DEPC分解成CO2和H2O） 抑制内源性RNase的活性 细胞裂解后RNase随之释放，应及时加入其抑制剂，如异硫氰酸胍。 注意事项 RNase活性抑制：物理法（高温），化学法（DEPC、VRC【氧钒核糖核苷复合物】、H2O2），生物法（RNasin）。 不同组织样品的预处理（如组织块、贴壁细胞） 每10 5~10 7细胞可提取50~100ugRNA。样品体积不要超过裂解液的10%。 样品保存：样品用Trizol打散后于-70℃可保存一个月以上。分离的RNA最好尽快反转录成cDNA等，保存在75%乙醇中于2~8℃一周，-20℃一年。 结果分析 电泳后应该是有3条主带，尤其是28S和18S两条带锐利清晰且亮度比约2:1，无DNA杂带及向前拖尾现象（无降解）。 纯品RNA和DNA的OD260/OD280（R）应为2. 0和1.8，所以提取RNA的R值应保证在1.8~2.0，R<1.8表示有蛋白、DNA或有机溶剂污染，R>2.2表示有降解。Tris水溶解RNA应保证2.0<R<2.2。 -70℃和-20℃保存无明显差异，否则为内源性RNase污染。 *